TGFβ信号通路对于细胞分裂、分化和凋亡极其重要,其异常的调节可能导致一系列包括癌症在内的严重疾病。目前对于RNA m~6A修饰在TGFβ信号通路中扮演的角色尚不清楚。通过前期预实验发现经过TGFβ诱导之后,雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系MCF7的m~6A总体水平有所上调,进一步通过Western blot检测甲基转移酶的表达水平,发现WTAP和METTL3上调。RNA-Seq结果表明,TGFβ诱导重构了MCF7细胞的转录组,上调的mRNA富集在细胞周期通路,表明TGFβ诱导影响MCF7细胞周期。为了探究m~6A修饰与TGFβ信号通路的相关性,本文执行了RNA甲基化测序实验(MeRIP-Seq)。传统的MeRIP-Seq方法需要数百微克的总RNA,以便于抽取mRNA。本文先对传统的MeRIP-Seq方法进行了改良,以单链DNA探针去除核糖体RNA(rRNA),并确定了RNA片段化的最优条件,从而降低了总RNA用量。改良的MeRIP-Seq结果显示,该法能够准确测出转录组中m~6A修饰位点。利用改良的MeRIP-Seq方法,对TGFβ诱导的MCF7细胞进行了m~6A表达谱测序。测序结果表明在MCF7细胞里面,TGFβ处理后m~6A表观转录组发生重编程,部分基因m~6A水平上调,并且此部分基因富集在TGFβ信号通路。Western blot结果表明,TGFβ信号通路的核心转录因子SMAD2和SMAD3的磷酸化水平随着m~6A甲基转移酶WTAP的敲低而受损,提示m~6A影响TGFβ信号通路的活性。TGFβ的诱导使得细胞周期抑制基因JunB的RNA水平和m~6A水平均显示上调,western blot实验证明,Jun B表达量直接受到WTAP的正向调控。此外,敲低WTAP之后,细胞周期标志物CDK4和p21不再随TGFβ的诱导而变化。从细胞水平上,流式细胞术表明由TGFβ引起的乳腺癌细胞MCF7周期阻滞,在敲低WTAP之后恢复。CCK8结果证明在WTAP敲低型的MCF7乳腺癌细胞中,TGFβ引起细胞增殖抑制受损,提示WTAP是引起乳腺癌MCF7细胞增殖抑制的重要因子。从TCGA数据库上分析乳腺癌病人预后的结果可知,WTAP的低表达与乳腺癌患者的不良预后有关。综上所述,本文利用改良MeRIP-Seq方法对TGFβ诱导乳腺癌细胞周期阻滞的分子机制做了一个初步探索。结果表明TGFβ的体外刺激可引起乳腺癌细胞周期阻滞,其分子机制主要依赖于甲基转移酶WTAP通过介导m~6A表观转录组的重构引起乳腺癌细胞周期阻滞的发生,从而引起增殖抑制,为解释TGFβ在乳腺癌细胞中抑制增殖的机制提供了新的思路。