桦褐孔菌一般生长于寒冷的区域,俄罗斯,芬兰等地都具有其较为合适的生长环境。作为真菌中的一类,其形态也独具特色,一般情况下,桦褐孔菌表面干裂,有大量黑色素产物积累,这些黑色素一部分为颗粒状,与细胞壁铰链在一起,另一部分为水溶性。基于antiSMASH分析发现,桦褐孔菌水溶性黑色素与非核糖体肽聚酮基因簇密切相关,该基因簇不仅包含nrps-pks基因,同时还具有AAA、HCP、DP及PK等10个基因。本文中主要研究的是DP基因,根据该基因簇的分析表明,DP基因具有肽键水解酶结构域,我们推测其为一种二肽酶,可能对nrps-pks的表达产物具有结构修饰作用;并且科学研究表明二肽酶以及通过二肽酶逆向催化作用合成的二肽在食品、医药、饲料及生物学等方面的应用越来越广泛,因此研究该基因簇中DP的功能具有重要的科学意义。基于上述信息,本文主要开展了以下研究:1:基于生物信息学的分析,通过NCBI、Prota Param、Signal P4.1、TMHMM2.0、SWISS-MODEL等在线分析软件分析DP基因的理化性质、信号肽、跨膜结构域以及三维结构,以此为导向进行下一步的研究。2:构建含跨膜区DP基因的重组质粒TDP-p PICZαA,与构建好的无跨膜区DP基因重组质粒DP-p PICZαA分别转化至毕赤酵母x-33,探究跨膜区的有无对其蛋白表达的影响。3:乳酸乳球菌在表达膜蛋白时具有明显的优势,构建含跨膜区优化后DP基因的重组质粒ODP-p NZ8148,运用乳酸乳球菌NICE系统进行表达。4:纯化毕赤酵母表达的无跨膜区DP重组蛋白,采用酶-底物反应,茚三酮显色对其功能进行初步验证,并探究其对二肽底物Gly-Gly及三肽底物Gly-Gly-Gly的酶学性质。结果显示:该DP基因编码区全长1395bp,编码465个氨基酸,其与膜二肽酶的相似性最高,同时DP不具有信号肽,具有跨膜结构域,进一步说明DP属于膜蛋白,并不属于分泌蛋白;将含跨膜区及无跨膜区DP基因重组质粒转化至毕赤酵母中进行诱导表达发现含跨膜区DP无法在毕赤酵母中表达,而无跨膜区DP实现了在毕赤酵母中的表达,说明跨膜区的存在影响了其在毕赤酵母中的表达水平;但我们仍然期望表达含跨膜区DP,我们又通过乳酸乳球菌的NICE系统成功表达了优化后含跨膜区DP基因的重组蛋白,为后续实验中探究含跨膜区及无跨膜区DP蛋白酶活差异奠定了基础;最后,将毕赤酵母表达的无跨膜区重组蛋白纯化,对DP膜蛋白功能进行初步验证,本实验发现其确实具有二肽酶的功能,并且其以Gly-Gly为底物时,表现出较好的活性。而该二肽酶的特异性有待进一步研究。