据统计世界范围内大约有10%-20%的已婚夫妇遭遇生育困难,由于男性生殖能力异常所致的不育接近50%。并且随着我国经济迅速发展,有害的环境因素不断增加以及受不良生活习惯的影响,人类精液质量呈现下降趋势。人类精子库是指以治疗不育症以及预防遗传病等为目的,利用超低温冷冻技术,采集、检测、保存和提供精子的机构。人类精子库的建立为那些患有不可逆的无精子症、严重少、弱、畸形精子症及有遗传性疾病风险的患者提供了一种可供选择的方法。然而,人类精子在冷冻复苏后其活力、活率、获能、顶体反应等功能发生相应的减退,目前认为在冷冻复苏过程中,精子细胞内外的渗透压的改变是造成精子超微结构发生破坏的主要原因,但是超微结构的改变并不能直接解释其功能的损伤。由于蛋白质是细胞功能的重要执行者,了解精子冷冻复苏后蛋白质的改变对理解精子冷冻损伤机制具有重要的意义。因此,我们前期利用蛋白质组学的方法对我中心精子库9名健康志愿者的精液标本进行冷冻前后的差异蛋白质组学研究,发现了在三羧酸循环通路中的乌头酸水合酶(AC02)可能在人类精子冷冻损伤中发挥了重要作用。通过免疫印迹实验的验证证实了其在复苏精子中的表达下降,与蛋白质组中的结果一致,免疫荧光实验明确了其主要定位于精子中段线粒体鞘区域,通过文献复习及蛋白定位信息提示AC02可能参与了线粒体内三羧酸循环的过程,其冻后降解使得三羧酸循环释放ATP产量降低可能是导致精子复苏后活力下降的原因。我们进一步检测了冷冻前后精子内ATP含量的变化、线粒体膜电势的变化及三羧酸循环通路中AC02下游产物异柠檬酸含量的变化,发现冷冻复苏后ATP、异柠檬酸的含量显著下降,线粒体膜电势显著降低,差异均有统计学意义。综上所述,通过对差异蛋白AC02的一系列研究,我们提出了以下观点,AC02作为线粒体蛋白在精子冷冻复苏后发生了蛋白降解,使得下游产物异柠檬酸的产量下降,三羧酸循环受抑制导致了ATP的产生下降,复苏后的精子活力受损。通过对该机制的阐述,为研究人类精子冷冻损伤机制奠定了良好的理论基础,并为进一步全面地应用蛋白质组学技术筛选、分离、鉴定精子蛋白提供了系统、且详细的研究方法,同时为临床改进精子冷冻保护剂改善精子冻后活力提供了改进思路和作用靶点。