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萘酰亚胺衍生物在治疗肿瘤中的作用显著,已成为了抗肿瘤药物研究的热点之一。其中依利萘法德和双萘法德均已进入了II期临床研究阶段,但是由于其具有较大的毒副作用而未能进入III期临床试验。因此设计开发一类毒副作用更小、抗肿瘤活性更强的新型萘酰亚胺衍生物,并寻找和阐明诱导肿瘤细胞凋亡的作用靶点和分子机制,已成为目前研究的重要课题。本研究探讨了不同长度烷基异硫脲阳离子作为连接基的5种新型双萘酰亚胺衍生物DN2-DN6对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用以及作用靶点,并从中筛选出了具有高效抗肿瘤活性的化合物,进一步探讨其对肿瘤细胞的凋亡作用以及分子机制。MTT法检测了5种新型双萘酰亚胺衍生物DN2-DN6对MCF-7细胞的生长抑制作用。结果可见,DN2-DN6均能显著抑制MCF-7细胞的生长,降低细胞存活率。5种化合物DN2-DN6的IC50值由小到大的顺序依次为DN6<DN5<DN4<DN3<DN2,说明化合物对MCF-7细胞的生长抑制作用随烷基异硫脲阳离子连接基长度的增加而增强,烷基链长度与细胞毒性间具有正相关性。其中DN6对细胞的生长抑制作用最强,在作用MCF-7细胞12、24和36h的IC50值分别为11.704±1.84、9.42±2.07和8.04±0.23μmol/L。因此选择DN6探讨其对MCF-7细胞的凋亡作用以及分子机制。采用DAPI荧光染色观察细胞形态、PI单染检测细胞周期分布、AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡率。结果表明DN6以浓度依赖方式诱导MCF-7细胞凋亡,并能干扰DNA的正常合成,造成MCF-7细胞周期阻滞于S期。通过DN2-DN6与中性红(NR)的共定位,观察5种化合物在MCF-7细胞中的作用靶点,吖啶橙(AO)染色观察溶酶体膜稳定性,ELISA法检测组织蛋白酶B (CathepsinB)和细胞色素C的表达量,流式细胞术(FCM)分析Bcl-2和Bax蛋白表达水平以及线粒体膜电位的变化,分光光度法检测Caspase-9和Caspase-3的表达。结果表明,DN2-DN6均定位于细胞溶酶体中。DN6能以浓度和时间依赖性的方式导致溶酶体膜通透性增加,释放出Cathepsin B,作用于Bcl-2蛋白,Bcl-2/Bax蛋白比率降低,进而引起线粒体膜电位下降,细胞色素C的释放,激活Caspase-9和Caspase-3,最终经由溶酶体-线粒体途径引起MCF-7细胞凋亡。