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引言体外循环心脏外科手术，病人需经历缺血再灌注的过程。部分病人虽然心脏病变矫治满意，但术后仍发生低心排综合征，严重者可导致患者死亡。临床观察注意到心脏术后诸多并发症与心肌损害的程度密切相关。手术中如何保护好心肌，以减少缺血缺氧及再灌注所造成的心肌损害是心脏外科面临的一个重要课题。目前临床上使用的各种心肌保护技术绝大多数采用高钾使心脏去极化停搏，如St.Thomas停搏液。虽然高钾停搏液可起到良好的心肌保护作用，但临床和实验均报道这些液体会引起一些不良后果，如心脏收缩功能下降，传导障碍，细胞水肿等。尤其是对一些术前心功能不全、复杂心脏畸形手术时间较长的病人，在术中如何更好地保护心肌，避免术后并发症的发生。因此有必要进一步研究心脏停搏液，使其保护作用更加完美。目前认为抑制线粒体渗透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的开放是预防和治疗缺血再灌注损伤较有前途的干预手段之一。MPTP抑制剂环孢素A（cyclosporin A，CsA）和线粒体ATP敏感钾(mitochondrial ATP-sensitive K+ channel，mitOKATP)通道开放剂二氮嗪（diazoxide）能直接或间接抑制MPTP开放，从而起到心肌保护作用。本研究采用离体心脏灌流、电镜、细胞内钙测定、心肌细胞线粒体膜电位测定、心肌线粒体渗透性转换的检测等方法，在多个层次对成熟大鼠缺血心肌进行观察，探讨心肌缺血再灌注损伤的病理生理及MPTP抑制剂和mitoKATP通道开放剂对成熟大鼠缺血心肌的保护作用和有关机制。第一部分线粒体渗透性转换孔抑制剂环孢素A和线粒体ATP敏感钾通道开放剂二氮嗪对成熟大鼠缺血心肌的保护作用研究目的：本实验旨在观察及了解MPTP抑制剂CsA和mitoKATP通道开放剂diazoxide强化的St.Thomas停搏液对缺血心肌的保护作用。方法：成熟雄性SD大鼠45只，随机分为5组：St.Thomas；30μmol／L diazoxide+St.Thomas；0.2μmol／L CsA+St.Thomas；0.2μmol／L CsA+20μmol／L atractyloside+St.Thomas和30μmol／L diazoxide+100μmol／L 5-HD+St.Thomas。每组9只，给予含不同成分的停搏液处理。离体心脏悬挂于改良Langendorff灌流装置，K-H液平衡20min后，灌注停搏液，各组均30min重复灌注一次停搏液，每次20ml，共灌注4次。心脏置于4℃环境中，缺血120min，再K-H液灌注60min。检测指标：①左心室功能测定：进行计算机采集和分析，计算左心室发展压、左心室舒张末压、左心室压力最大上升和下降速度的变化；②冠状动脉流量测定；③心肌酶值LDH、CK、AST测定；④心肌超微结构电镜检查，评价心肌保护效果。结果：再灌注后diazoxide或CsA强化的St.Thomas停搏液组与St.Thomas组比较，可显著促进低温缺血心肌的功能恢复，冠脉流量增加明显，显著降低心肌酶LDH、CK、和AST的漏出（P＜0.05），明显减轻心肌超微结构的损伤，而MPTP开放剂atractyloside和diazoxide的拮抗剂5-HD阻断了它们的效应（P＜0.05）。结论：MPTP抑制剂CsA和mitoKATP通道开放剂diazoxide可增强St.Thomas停搏液对缺血心肌的保护作用。第二部分线粒体渗透性转换孔抑制剂环孢素A和线粒体ATP敏感钾通道开放剂二氮嗪对成熟大鼠缺血心肌保护作用的机制研究（一）环孢素A和二氮嗪对成熟大鼠心肌细胞内钙和线粒体膜电位的影响研究目的：本文从心肌细胞水平探讨MPTP抑制剂CsA和mitoKATP通道开放剂diazoxide对缺血心肌保护作用的机制。方法：离体成年雄性SD大鼠心脏，用酶解法取得心肌细胞后，随机分为6组：K-H液；St.Thomas；30μmol／L diazoxide+St.Thomas；0.2μmol／L CsA+St.Thomas；0.2μmol／L CsA+20μmol／L atractyloside+St.Thomas和30μmol／L diazoxide+100μmol／L 5-HD+St.Thomas。各组心肌细胞置于不同的停搏液中，30min更换一次停搏液，4℃下保存2h后进行细胞内游离钙离子浓度、线粒体膜电位（Δψm）和细胞死亡率测定。结果：①心肌细胞内钙离子浓度测定结果显示，各组细胞Fluo-3荧光强度的差异无统计学意义（P＞0.05）；②Δψm测定结果显示K-H液组和St.Thomas液组TMRE荧光强度显著增加，提示Δψm去极化，而CsA或diazoxide强化的停搏液组TMRE荧光强度较K-H液组和St.Thomas液组低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示CsA或diazoxide强化的停搏液阻止了Δψm去极化，但5-HD和atractyloside减弱了diazoxide和CsA的效应，这二组细胞的TMRE荧光强度显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。激光扫描共聚焦显微镜照片证实，CsA和diazoxide强化的停搏液组TMRE荧光强度较低，而其他组TMRE荧光强度较强；③K-H液组和St.Thomas液组细胞死亡率分别为61.7±2.1％和62.0±3.1％，而diazoxide组和CsA组细胞死亡率较低，分别为54.5±3.2％和53.8±3.1％，差异有统计学意义（P＜0.05），但5-HD和atractyloside减弱了diazoxide和CsA的保护效应，这二组细胞死亡率分别为59.9±2.5％和59.2±3.0％，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：MPTP抑制剂CsA和mitoKATP通道开放剂diazoxide强化的停搏液能抑制MPTP的开放，阻止Δψm去极化，降低心肌细胞的死亡率，增强高钾停搏液的心肌保护作用。（二）环孢素A和二氮嗪对成熟大鼠缺血心肌线粒体渗透性转换的影响研究目的：本文从心肌线粒体水平探讨MPTP抑制剂CsA和mitoKATP通道开放剂diazoxide对缺血心肌保护作用的机制。方法：成熟雄性SD大鼠18只，随机分为6组：K-H液；St.Thomas；30μmol／L diazoxide+St.Thomas；0.2μmol／L CsA+St.Thomas；0.2μmol／L CsA+20μmol／L atractyloside+St.Thomas和30μmol／L diazoxide+100μmol／L 5-HD+St.Thomas。每组3只，给予含不同成分的停搏液处理。离体心脏悬挂于改良Langendorff灌流装置，K-H液平衡20min后，灌注停搏液，各组均30min重复灌注一次停搏液，每次20ml，共灌注4次。心脏置于4℃环境中，缺血120min后，采用差速分级离心法分离线粒体，200μmol／L的CaCl2作用于线粒体，连续观察520nm处线粒体吸光度（A520）的变化15min，该变化反映线粒体肿胀程度，提示线粒体渗透性转换孔的开放情况。结果：应用MPTP特异性抑制剂CsA或mitoKATP通道开放剂diazoxide强化的高钾停搏液处理后的心脏分离的线粒体，在200μmol／L的CaCl2作用下A520明显下降，提示在外源性钙刺激下MPTP大量开放，与K-H液组、Thomas液组相比差异有显著性意义（P＜0.001），而MPTP开放剂atractyloside和diazoxide的拮抗剂5-HD阻断了它们的效应，差异有显著性意义（P＜0.001）。结论：MPTP特异性抑制剂CsA和mitoKATP通道开放剂diazoxide能抑制MPTP开放，阻止线粒体渗透性转换的发生，增强高钾停搏液的心肌保护作用。