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第一部分缺氧对原代培养海马神经元凋亡及Tyro 3/Akt信号的影响目的:建立海马神经细胞原代培养模型,检测缺氧对海马神经细胞凋亡及Tyro 3/Akt信号影响,以探讨Tyro 3/Akt信号在缺氧导致海马神经细胞损伤中的作用。方法:培养原代海马神经细胞,以MAP 2免疫荧光法鉴定海马神经细胞纯度,将培养的细胞随机分为对照组、缺氧组A(缺氧12h)、缺氧组B(缺氧24h),在倒置显微镜下观察细胞形态,以MTT法测细胞增殖活力,运用TUNEL法测细胞凋亡,采用免疫荧光法测细胞Tyro 3蛋白的表达,运用Western blot法测Akt磷酸化水平。结果:1.经MAP 2免疫荧光法鉴定,原代培养的神经细胞纯度达89%,基本达到实验所需;2.缺氧抑制神经细胞增殖活力(P<0.01),导致细胞凋亡(P<0.01),并呈时间依赖性(P<0.01)。3.缺氧抑制细胞Tyro 3蛋白表达(P<0.01),降低Akt的磷酸化水平(P<0.01),并随缺氧时间的延长呈加重的趋势。结论:缺氧具有抑制海马神经细胞增殖,促进细胞凋亡的作用,并且Tyro 3/Akt信号受抑制在缺氧导致海马神经细胞损伤过程中起重要作用。第二部分Gas 6/Tyro 3/Akt信号在原代培养缺氧海马神经元中的保护作用目的:采用原代培养海马神经细胞进一步探讨Gas 6/Tyro 3/Akt信号对缺氧海马神经元的保护作用。方法:原代培养缺氧海马神经细胞,将细胞分为对照、缺氧、Gas 6(a)、Gas 6(b)、Gas 6(c)组,在倒置显微镜下观察细胞形态,以MTT法测Gas 6对缺氧神经细胞的增殖活力影响,运用TUNEL法测Gas 6对缺氧细胞的凋亡影响,以免疫荧光双标染色法测Gas 6对细胞Gas 6和Tyro 3蛋白的表达的影响,采用Western blot法测Gas 6对细胞Akt磷酸化的影响。结果:1.Gas 6明显改善缺氧海马神经细胞的增殖活力(P<0.01),抑制缺氧细胞凋亡(P<0.01);2.Gas 6明显改善缺氧细胞和Tyro 3蛋白表达(P<0.01), 并提高Akt磷酸化水平(P<0.01)。结论:本部分研究证实Gas 6通过促进海马神经细胞Tyro 3蛋白表达、促进Akt磷酸化,从而抑制海马神经细胞凋亡。第三部分Gas 6/Tyro 3/Akt信号对缺血缺氧大鼠海马神经元的保护作用目的:通过缺血缺氧大鼠模型进一步探讨Gas 6/Tyro 3/Akt信号对缺血缺氧大鼠海马神经元的保护作用。方法:双侧颈总动脉结扎法制备缺血缺氧大鼠模型,将大鼠随机分为正常、缺血、Gas 6(a)、Gas 6(b)、Gas 6(c)、Gas 6(d)组,经侧脑室注射Gas 6重组蛋白溶液,以TUNEL法测大鼠海马神经细胞凋亡,用免疫荧光双标法测大鼠海马神经细胞Gas 6和Tyro 3表达,以Western blot法测海马Akt磷酸化水平。结果:1.模型组大鼠海马CA1区凋亡的细胞数明显高于正常组(P<0.01);2.模型组海马Tyro 3和Gas 6荧光强度明显低于正常组(P<0.01);3.模型组海马Akt磷酸化水平明显低于正常组(P<0.01);4.Gas 6抑制缺血组海马神经细胞凋亡(P<0.01),改善缺血组Tyro3(P<0.01),促进缺血组海马Akt磷酸化(P<0.01)。结论:海马神经细胞Gas6/Tyro 3/Akt信号受抑制是缺血缺氧脑损伤重要发病机制之一;Gas 6改善缺血缺氧大鼠海马Tyro 3蛋白表达,提高Akt磷酸化水平,从而改善神经细胞的凋亡,发挥神经保护作用。