研究背景及目的胃癌(Gastric cancer)是我国最常见的一种消化道恶性肿瘤,发病率占全球的42%左右,病死率位居第二,严重威胁着人类的身体健康。传统诊断方法包括钡餐造影X射线诊断、B超检查、纤维胃镜检查和CT检查等,但是,这些方法灵敏度较低,对于较小的瘤体容易漏检,使患者错过最佳治疗时机。临床治疗主要包括西医的五大治疗手段(手术、放疗、化疗、热疗、免疫治疗)与中医的对症治疗,但是由于胃癌具有较强的增殖和转移能力,从而导致远期治疗和预后效果不理想,使胃癌患者面临临床难治疗的问题。肿瘤基因功能研究是目前世界生物医学领域中的研究热点,因此从分子水平深入研究胃癌的发病机制,为胃癌的早期诊断、治疗和预后提供了新策略。RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)能特异有效地抑制靶基因的表达,目前已被广泛应用于基因功能探索及恶性肿瘤基因治疗领域之中。膜联蛋白A2(Annexin A2, ANXA2)乒肿瘤细胞增殖、侵润、转移、粘附及癌症的发生发展过程中具有重要的调控作用。本课题组在“膜联蛋白A2对人胃癌SGC-7901细胞生物学行为影响”的研究中发现,ANXA2在胃癌细胞中呈高表达,其对胃癌细胞的增殖具有明显的强化作用。本文以ANXA2为靶点,应用RNAi技术对ANXA2表达进行抑制,利用免疫荧光、免疫细胞化学染色、考马斯亮蓝染色和扫描电子显微镜,就ANXA2与人胃癌SGC-7901细胞的微结构调节的关系进行研究。研究ANXA2对细胞微结构改变及骨架动态组装的影响,进一步揭示该基因过表达在肿瘤发展过程中的意义,为探索ANXA2对肿瘤生物学行为的影响提供实验依据,为肿瘤的防治和预后提供思路。因此,不断探究SGC-7901细胞恶性转化相关基因在胃癌发展过程中的作用机制,有助于对胃癌进行早诊断和早治疗。方法1.采用磷酸钙共沉淀法将靶向ANXA2的干扰重组质粒导入SGC-7901细胞中。2.利用扫描电子显微镜观察ANXA2对SGC-7901细胞表面超微结构重塑的影响。3.利用免疫荧光、免疫细胞化学染色法和考马斯亮蓝染色法,检测SGC-7901细胞的F-actin、β-tubulin、Vimentin和LaminB的表达及分布情况,并分析了它们的平均光密度值。4.通过EB荧光染料检测了ANXA2对SGC-7901细胞膜通透性的影响。5.激光共聚焦扫描显微镜检测SGC-7901细胞中ANXA2和细胞黏着斑激酶(FAK)的共定位表达情况。结果1.磷酸钙共沉淀法转染SGC-7901细胞的最佳条件：转染前细胞汇合率达到>60%、6μg重组质粒、1701μl DNA-磷酸钙沉淀复合物且沉淀20mmin、孵箱内16h孵育,此条件下转染效率高达90%。2.利用磷酸钙转染法将靶向ANXA2的重组质粒导入SGC-7901细胞后,扫描电镜检测结果显示,ANXA2表达被抑制后,细胞表面微绒毛及伪足等结构发育受损,并呈时间依赖性。3.抑制ANXA2表达后,细胞整体形态发生改变；细胞F-actin纤维束减弱；p-tubulin表达减少,分布组织性变差；Vimentin分布弥散无序；LaminB表达减少；且它们的平均光密度均有一定程度的降低。4.抑制ANXA2表达后,经EB染色后细胞核部位出现较强的红色荧光。5.激光共聚焦扫描显微镜检测细胞中ANXA2和黏着斑激酶(FAK)共定位于胞膜、胞质和胞核中。结论抑制ANXA2基因表达后导致SGC-7901细胞的外观形态改变,并引起细胞骨‘架系统重塑以及细胞的恶性程度发生变化。.ANXA2可能是参与调控SGC-7901细胞骨架系统结构变化的重要因素,尤其是对丝状肌动蛋白(F-actin)的动态组装的影响最为显著,进而导致细胞运动相关形态结构的变化。因此,ANXA2可作为人胃癌诊断及治疗的潜在靶点。