应激性溃疡(stress ulcer, SU)是临床上危重疾病的常见并发症，胃粘膜缺血是应激性溃疡的主要发病机制，胃酸在此基础上起重要作用，但在不同应激状态下，胃酸在应激性溃疡发病中的确切作用以及所起作用大小尚未完全阐明。 目前，动物实验中最常用的应激性溃疡模型除水浸-束缚应激模型，文献关于应激性溃疡的研究大多只限于一种动物模型，这极大限制了对其复杂的发生机制的研究。因此本实验选择了烧伤、颅脑外伤、败血症以及水浸束缚四种动物模型，研究胃酸在应激性溃疡发生中的作用。 胃壁细胞的主要功能是分泌HCl使胃腔酸化，它通过壁细胞膜上的质子泵(H~+／K~+-ATP酶)的质子转运而实现。壁细胞特征性的超微结构主要包括含有微绒毛的分泌小管，胞浆内的管泡囊结构以及大量的线粒体，其超微结构随壁细胞泌酸功能的变化而改变，根据其形态可以判断壁细胞泌酸活性。本实验即应用免疫荧光技术研究不同躯体应激状态下壁细胞质子泵的分布及细胞形态的变化，进一步阐明在不同躯体应激状态下胃酸分泌状态及其发生机制。 材料与方法 1．动物分组及模型制作 健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组，水浸束缚2、4h组，烧伤24、48h组，败血症24、48h组，颅脑外伤后4、8h组(每组5只)，实验前禁食24h，禁水1h。 大鼠四肢及头部束缚于鼠板后垂直浸入19℃±1℃水浴中，使水平正立位大鼠的胸骨剑突水平，分别于水浸-束缚应激(WRS)2h、4h后处死。 大鼠背部去毛后置于100℃水浴中12秒，造成30％体表面积(TBSA)三度烫伤，于伤后1h以40ml／kg等渗盐水腹腔注射复苏，放回鼠笼，自由饮水，仍禁食，分别于伤后24、48h处死。 取大鼠下腹部正中央切口，找到盲肠后在其中央结扎，并在已结扎盲肠远段正中贯通穿刺，然后关闭腹腔。术后按40ml／kg体重皮下注射生理盐水，放回鼠笼，自由饮水，仍禁食，分别于伤后24、48h处死。 大鼠头部于中线切开头皮，剥离骨膜，在前囟和人字缝尖连线中点偏左4mm处颅骨钻孔，骨窗直径为4.8mm，暴露硬脑膜。在前囟和人字缝尖附近颅骨外板上固定2枚小螺丝钉，牙托水泥固定打击管后，缝皮。1d后用液压打击致伤，分别于伤后4、8h处死。 2．胃液pH值测定、胃溃疡指数评定以及胃壁细胞形态观察 模型制作完成后，大鼠在戊巴比妥钠麻醉后，剖腹并游离胃，于皮胃区剪一小切口测胃液pH值。取下胃后，评估胃溃疡指数(ulcer index, UI)；于腺胃区粘膜损伤明显处，第二军医大学硕士学位论文中文摘要用小组织剪剪下0.scmxo.scm大小的胃粘膜标本，行常规病理组织学检查。于腺胃前后壁中央处，剪取0.scmxo.scm大小的胃粘膜标本，放入改良Bouin’s液的小瓶内固定后脱水，通过免疫荧光抗体标记胃壁细胞H+/K十一ATP酶和/或线粒体后在常规荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜下检查，观察壁细胞形态变化并分类计数。3.数据处理 所有实验数据均以均数士标准差(志)表示，分析各组动物模型胃液PH、溃疡指数同分泌期壁细胞数之间的关系。各应激模型不同应激时间组的比较以及与正常对照组的对照采用t检验，两变量之间的关系采用直线相关分析。 结果1.正常大鼠组 大鼠胃液pH值为2.60士0.31，免疫荧光标记壁细胞形态可分为网格样型、弥漫型两种，网格样细胞为具有泌酸活性的壁细胞，网格样型细胞数为86.2士7.23。胃液PH值与分泌期壁细胞数呈负相关(r=一0.81，p<0.05)。双重免疫荧光标记壁细胞大多可见线粒体与H十服十一ATP酶分离以及混合分布两种，线粒体与H十服十一ATP酶分离壁细胞处于静息状态。2.水浸束缚应激组大鼠 wRS Zh组胃液pH值为1 .85士0.28，较对照组显著降低(p<0.01)，wRS 4h组胃液pH值为1.29士0.06，与对照组差异显著(p<0.01)，和wRS Zh组相比无显著差异(p>0.05)水浸束缚应激2h组胃UI为22.60士2.07，明显高于对照组(p<0.01);水浸束缚应激4h组大鼠胃Ul高达35.60士1.82，明显高于应激Zh组(p<0.01)。 免疫荧光标记后在激光共聚焦扫描显微镜镜下观察胃粘膜全层均分布有壁细胞，WRSZh组分泌期壁细胞数为112士7.8;WRS4h组分泌期壁细胞数为165.2士4.2，两组大鼠胃液pH值与胃UI呈负相关(r=一0.85，p<0.05)，胃液pH值与分泌期壁细胞数呈负相关(r=一0.89，p<0.05)，两组分泌期细胞数均显著多于正常对照组(p<0.01)。4h组显著多于2h组(p<0.01)。双重免疫荧光标记壁细胞多处于分泌状态。3.烧伤组大鼠 烧伤24h组胃液pH值为3.30士0.42，较对照组显著升高(p(0.01)，烧伤48h组胃液pH值为3.44士0.22，与对照组差异显著(p<0.01)，和烧伤24h组相比无显著差异(p>0.05)。烧伤24h组大鼠胃Ul为15.80士3.11，明显高于对照组(p<0.01);烧伤 48h组大鼠的胃Ul达27.00士4.00，明显高于烧伤24h组(p(0.01)。 烧伤24h组分泌期壁细胞数为63.4士7.13，烧伤48h组分泌期壁细胞数为52.6士4.67，胃液pH与胃UI无明显相关，胃液PH值与分泌期壁细胞数负相关(r二一0.57，p<0.05)。两组大鼠分泌期壁细胞数均低于对照组(p<0.01)，两组之间无明显差异。4.败血症组大鼠第二军