前言：　　 糖尿病(diabetesmellitus,DM)是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病群,其引起的慢性并发症可遍及全身各重要器官。糖尿病肾病(diateticnephropathy,DN)是主要的微血管病变之一,25%-40%的糖尿病患者20年内都会发生DN,是1型糖尿病(type1diabetesmellitus,T1DM)患者的主要死亡原因,己成为发达国家慢性肾衰竭的首要因素。　　 DN的发病机制非常复杂,尚未完全阐明。目前公认的是糖、脂代谢紊乱及其导致的血流动力学异常,两者交互作用是DN发生的始动因素。糖代谢增强导致的反应性氧化应激,巨噬细胞活化引起的慢性炎症是DN发生发展的重要因素。肾小球高滤过和肾脏肥大是早期DN的特点,继续发展则出现基底膜增厚,肾小球系膜增生,微量白蛋白尿,肾脏的重度炎性反应,肾小球硬化和小管间质纤维化等,导致终术期肾功能衰竭。　　 目前对于DN尚缺乏有效的治疗手段,临床主要应用改善血压和控制血糖的药物治疗,必要时进行血液透析。这些疗法均需终身性治疗、费用昂贵,治疗效果不理想,只能减慢并不能阻止DN的进程,不能起到保护肾脏和改善肾功等本质性作用。细胞治疗是指利用细胞的某种特性,采用细胞工程方法使这些细胞具有免疫调节、杀灭病原体,促进组织再生和机体康复等治疗效果,目前已成为治疗疾病的有效手段。但细胞种类的选择很关键,干细胞因具有自我更新、定向分化及免疫调节能力,是理想的种子细胞来源。胚胎干细胞很难获得大量可定向分化的纯度较高的种子细胞,又涉及伦理学问题。因此目前真正用于组织构建、器官修复和细胞治疗的种子细胞仍然是自体来源的成体干细胞。　　 骨髓干细胞(bone marrowme senehymal cells,BMSCs)和脂肪干细胞(adipose deried stem cells,ADSCs)是研究较多的成体问充质干细胞。ADSCs除具有与BMSCs一致的自我更新、多向分化和免疫调节等干细胞特性外,还具有单位体积组织内干细胞含量大,取材简单安全、痛苦小等优点。脂肪组织分布广泛,不同部位脂肪组织来源的ADSCs也不尽相同。腹壁皮下脂肪组织取材方便无危险,由此获得的ADSCs具有明显的干细胞生物学特性,增殖能力强,具有实际应用价值。因此其作为ADSCs的代表,广泛应用在组织工程和细胞治疗等领域。大量研究表明ADSCs可以向多种组织、细胞分化。数据显示ADSCs经基因改造技术、在化学药物和细胞因子的诱导下,均可分化为胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs)。但基因技术的致突变性和化学药物的致毒性都限制其应用于临床,因此探讨一种安全有效的诱导方式意义重大。　　 研究表明BMSCs可以通过降低糖尿病大鼠的血糖,进而改善和治疗DN,而有关ADSCs对DN的治疗尚未见报道。但研究显示ADSCs可以通过抑制氧化应激和炎症反应来减轻大鼠肾缺血再灌注的损伤,ADSCs还能通过分化途径改善大鼠的急性肾衰竭、保护肾脏,ADSCs对糖尿病大鼠视网膜病变也有改善和治疗的作用。由此可见ADSCs具有保护细胞免受损伤、促进病变组织再生修复的重要作用。同时,ADSCs及其分化的IPCs能降低糖尿病大鼠的血糖水平已被确认,结果显示ADSCs具备治疗DN的潜能,明确ADSCs对DN的治疗效果及其作用机制意义重大。　　 为了探讨降糖作用对于DN的治疗,是否具有主导地位,本实验同时设立了ADSCs与IPCs两个治疗组。IPCs属于定向分化了的细胞,丧失了干细胞的生物学特性,只具有明显的降糖作用,因而可以作为携带降糖作用的单一因素,有助于明确干细胞治疗DN的作用机制。因此,本实验拟通过腹腔注射链脲佐菌素(Strep to zotocin,STZ)制备大鼠DN模型,向DN大鼠体内分别移植荧光标记的ADSCs和IPCs,从肾脏的病理改变,血尿生化指标,氧化应激指标,炎症因子及MAPK通路蛋白的表达等方面进行研究,比较ADSCs与IPCs对DN的改善及治疗效果,探讨应用细胞治疗DN可能的作用机制,为临床治疗DN提供新思路。　　 实验材料与方法：　　 一、实验材料　　 (一)实验动物　　 健康清洁级SD大鼠100只,体质量250-300g,雌雄不限,由中国医科大学实验动物中心提供。　　 (二)主要试剂　　 低糖DMEM、高糖DMEM、胎牛血清(Gibco),CD31-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD49d-PE、CD106-PE单克隆抗体(eBioscience),Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、β-甘油磷酸钠、油红O、L-脯氨酸、抗坏血酸、甲苯胺蓝、STZ、PKH26(Sigma),GDF-5(PeproTeeh),细胞周期检测试剂盒(凯基生物),尼克酰胺、活化素A、GLP-1(RD),大鼠胰岛素、C肽ELISA酶联免疫测定试剂盒(Mercodia),大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α酶联免疫检测试剂盒、MDA测定试剂盒(南京建成)。　　 二、实验方法　　 (一)大鼠ADSCs的分离培养与鉴定　　 分离大鼠腹股沟皮下脂肪组织,培养脂肪干细胞,相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测P3、P6、P9、P15细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期和表面抗原的表达。成骨、成软骨、成脂肪诱导后分别行茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色进行鉴定。　　 (二)体外诱导ADSCs分化为IPCs　　 取P3的ADSCs接种到6孔板,分4组:NA,NG,AG,NAG;采用先高糖后低糖培养基的两步诱导法培养。相差显微镜观察细胞形态变化,双硫腙染色鉴定IPCs内的锌离子,ELISA法检测IPCs对胰岛素及C-肽的分泌量,RT-PCR检测IPCs对胰岛β细胞相关基因mRNA的表达。　　 (三)ADSCs与IPCs移植治疗大鼠DN　　 STZ诱导SD大鼠制备DN模型,分别移植荧光标记的ADSCs和IPCs。荧光显微镜观察标记细胞的定位,PAS染色检测肾脏病理改变,检测血尿生化指标、氧化应激指标、炎症因子的表达,WesternBlotting检测超氧化物歧化酶及MAPK通路蛋白的表达。　　 实验结果：　　 一、大鼠ADSCs的生物学特性　　 SD大鼠的ADSCs类似成纤维细胞的长梭形,呈漩涡状生长。MTT结果显示ADSCs传代培养P15后增殖能力仍未降低。细胞周期检测发现ADSCs具有干细胞特性。流式细胞仪检测结果显示,ADSCs高表达间充质干细胞相关标志物CD90、CD44,不表达内皮细胞标记CD31,低表达CD49d,不表达CD106。成骨诱导后钙结节形成,茜素红染色阳性;成软骨诱导后分泌蛋白多糖,甲苯胺蓝染色阳性;成脂诱导后脂滴形成,油红O染色阳性。　　 二、ADSCs诱导分化为IPCs　　 ADSCs更换诱导培养液后细胞增殖缓慢,诱导21d时NAG组的细胞能形成胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性,并呈血糖浓度依赖性分泌胰岛素及C肽。诱导14d时仅能检测到PDXlmRNA,表明此时已分化出胰岛前体细胞,诱导21d时NAG组细胞可表达GLUT1、INS、PDX1mRNA,与正常大鼠胰岛β细胞表达水平相近,明显高于AG组。NAG组可以诱导ADSCs分化为有功能的IPCs。　　 三、ADSCs与IPCs移植治疗大鼠DN　　 大鼠经STZ注射12w后,血尿生化指标发生明显改变,符合DN模型标准。细胞移植4w后检测发现,ADSCs能改善肾功的生化指标,并修复肾组织的病理改变,IPCs对其改善并不明显。ADSCs和IPCs都能下调血糖水平,增加胰岛素分泌量。ADSCs能降低氧化应激产物MDA和蛋白质羰基含量,下调MnSOD和CuZnSOD的表达。减少炎症因子的分泌,抑制MAPK通路的激活。而IPCs不能抑制MAPK通路,对氧化应激及炎症反应没有明显改善。　　 结论：　　 1.采用Ⅰ型胶原酶消化法成功培养ADSCs,稳定增殖,表达间充质干细胞相关的表面抗原,具有成骨、成软骨和成脂肪的多向分化潜能。　　 2.尼克酰胺、活化素A和GLP-1能成功诱导ADSCs分化为有功能的IPCs。　　 3.ADSCs可以迁移到DN大鼠的肾组织内,修复坏死的肾组织、改善肾功能。抑制应激和炎症反应,延缓和逆转DN的发生发展。　　 4.IPCs仅能增加DN大鼠胰岛素的分泌量,降低血糖水平,而对于肾组织的保护和治疗作用不明显。