研究背景生长抑素受体阳性细胞多见于神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumours, NETs),它是来源于神经内分泌细胞的一大类肿瘤,多发生于消化系统,但可散在发生于人体其它多个器官。其最主要来源部位是胃肠和胰腺(占75%),称为胃肠胰神经内分泌肿瘤(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumours,GEP NETs)目前积极的外科手术治疗仍然是GEP NETs首选的方法。但由于病灶深藏在胃肠壁或腹膜后,早期诊断、精确定位困难,从而影响临床治疗效果。因此如何能对神经内分泌肿瘤进行早期诊断并精确定位成为国内外研究的重点。肿瘤学研究发现,NETs的细胞膜上均有生长抑素受体(somatostatin receptor, SSTR)的显著高密度分布。SSTR是一种G-蛋白偶联的细胞膜跨膜受体,有五种亚型(SSTR1-SSTR5), SSTR的配体是生长抑素(somatostatin,SST),目前引用较多的是生长抑素类似物(somatostatin analogues,SSTA)。SSTA可和SSTR特异性结合并进入细胞内。利用SSTA作为载体的功能,通过SSTR的内化机制将放射性同位素带到细胞内,造成肿瘤区域核素的浓聚,而被SPECT所检测,即生长抑素受体显像(somatostatin receptor scintigraphy,SRS)。SRS应用于NETs原发灶与转移灶的诊断,从上世纪90年代起,即已开始研究并应用于临床,已逐渐成为一种新的检查方法,目前在国外已广泛开展,但仅限于在同位素扫描方面。而在外科临床中,更需要了解病灶的精确空间定位以及其与周围脏器组织的关系,而这恰恰是MRI的优势所在。但MRI又不具有对NETs的特异性与敏感性。如何能将SRS跟MRI的优势互补,得到一种对NETs既具有特异性与敏感性,又具有高图像空间分辨力,能为外科医生提供清晰的三维空间图像,并能清楚的显示出病灶与周围组织器官的关系的这样一种检测方法成为我们所想要研究的方向。本研究旨在通过化学方法对MRI检测中常用的造影剂超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)进行修饰并实现和奥曲肽之间的耦联,得到一种SPIO-奥曲肽复合物,在奥曲肽与SSTR的特异性受体结合作用下实现Fe3O4颗粒选择性进入SSTR阳性肿瘤细胞内,形成细胞胞浆内Fe3O4颗粒的选择性聚集,局部驰豫时间发生极大的改变,行MRI扫描检测这种信号改变并获得图像,即生长抑素受体的磁共振分子成像(somatostatin receptor magnetic resonance molecular imaging, SRMRMI)。我们希望SRMRMI既能具有SRS的特异性与敏感性,又具有MRI的高图像空间分辨能力,从而为生长抑素受体阳性肿瘤的早期诊断及定位提供一个新的思路。全文共分为二个部分。目的：制备具有高分散性、稳定性、纳米层级的羧甲基葡聚糖改性磁性复合纳米Fe3O4粒子,并与奥曲肽偶联制成SPIO-奥曲肽偶联复合物。方法：采用超声预处理技术,在羧甲基葡聚糖.水分散体系中,通过化学共沉淀法制备羧甲基葡聚糖表面改性纳米粒子,偶联上奥曲肽后用红外光谱(IR)、原子力显微镜(AFM)、透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射(XRD)、振荡样品磁强(VSM)等对产物进行了表征。结果：(1)以氯化铁和氯化亚铁为铁源,葡聚糖为修饰剂,将反应溶液超声预处理后,通过化学共沉淀法,成功制备了羧甲基葡聚糖磁性纳米粒子(CMD-MNPs)。并通过酰胺键将奥曲肽以共价键连接于纳米微粒之上,得到CMD-MNPs-Oc。(2)通过对CMD-MNPs-Oc粒子扫描电镜分析：其粒径为50nm左右,粒径分布窄,呈现很好的球形。超声预处理混合溶液,能够很好阻止Fe3O4纳米粒子的团聚。葡聚糖的修饰没有改变Fe3O4的晶体结构,而且大大提高磁性纳米粒子的水溶性和稳定性。(3)通过外加磁场时磁化曲线的检测,证明CMD-MNPs-Oc粒子具有超顺磁性,室温下饱和磁化强度为35emu·g-1。结论：1.经超声预处理制备的复合纳米粒子的分散性较好,且仍保持Fe3O4的晶相结构。2.磁性复合纳米粒子经羧甲基葡聚糖改性后,在水溶液中的稳定性显著提高,并仍具有超顺磁性。注射液,超顺磁性目的：检测胰腺癌BXPC-3细胞与结肠癌HCT-116细胞生长抑素受体各亚型的表达,确定生长抑素受体阳性及阴性细胞株；生长抑素受体阳性肿瘤细胞是否能特异性的摄取偶联奥曲肽的SPIO；检测与偶联奥曲肽的SPIO共培养后生长抑素受体阳性细胞与生长抑素受体阴性细胞MRI信号的差异。方法：分别培养BxPC-3胰腺癌细胞、HCT-116结肠癌细胞。使用RT-PCR分别检测两种细胞内SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5的mRNA表达,以确定生长抑素受体阳性及阴性肿瘤细胞株。两种细胞常规培养至对数生长期,将相同浓度CMD-MNPs-Oc溶液分别加入各自的培养基中,继续共同培养,即分为两组：A组为CMD-MNPs-Oc孵育后的BxPC-3细胞；B组为CMD-MNPs-Oc孵育后的HCT-116细胞。然后在相同的孵育时间分别取细胞混悬液获取细胞沉渣行电镜检查,观察Fe3O4颗粒是否被内摄进入肿瘤细胞内,并对比Fe3O4颗粒在细胞内分布部位及量的情况。使用HE染色及普鲁士蓝染色两种方法定量检测Fe3O4颗粒分别进入生长抑素阳性肿瘤细胞和生长抑素阴性肿瘤细胞内的量(分组同电镜检测)。用MRI机器对处理后的细胞混悬液进行扫描,检测Fe3O4颗粒在细胞内的选择性聚集及其驰豫性的改变(A、B分组同电镜检测,C组为无细胞的纯培养液作为空白对照)。结果：RT-PCR结果显示BxPC-3细胞中SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5均呈现阳性表达,相反HCT-116细胞中则表现为阴性表达。电镜结果显示,在A组中,进入细胞内的Fe3O4颗粒较多,且多位于胞浆而不是线粒体内,并可见有小吞饮泡形成；在B组中,进入细胞内的Fe3O4颗粒很少,且位于溶酶体内。HE染色结果显示A组CMD-MNPs-Oc孵育后的BxPC-3细胞的胞浆中见较多散在颗粒状物,而B组CMD-MNPs-Oc孵育后的HCT-116细胞内则未见颗粒状物。进一步普鲁士蓝染色结果显示A组BxPC-3细胞的胞浆内较多深蓝色或青色Fe3O4颗粒,其阳性细胞百分比为97%,而B组HCT-116细胞的胞浆内则极少见深蓝色或青色Fe3O4颗粒,阳性细胞百分比在6%。MRI检测结果A组细胞MRI扫描T2加权图像信号强度明显低于C组空白对照组的信号(P<0.001),其信号强度下降率为69.6%,其信号强度也明显低于B组,差异具有统计学意义(P<0.001)结论：1. BxPC-3细胞中生长抑素受体呈阳性表达,HCT-116细胞中生长抑素受体呈阴性表达。2. CMD-MNPs-Oc能通过受体结合作用将Fe3O4颗粒特异性、靶向性的被摄取到生长抑素受体阳性细胞胞浆内。3. CMD-MNPs-Oc通过特异性、靶向性的将Fe3O4颗粒被摄取到生长抑素受体阳性细胞胞浆内,从而实现在MRI检测下生长抑素受体阳性细胞与生长抑素受体阴性细胞信号的明显差异。