亮叶杨桐叶中黄酮类化合物的分离制备及生理活性研究

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亮叶杨桐(Adinandra nitida)是一种主要分布于我国广西、广东、贵州等地的天然野生植物资源,以其鲜嫩叶制成的代茶—石崖茶(石芽茶)在华南民间有着悠久的饮用历史。石崖茶具有消炎解毒、降压、退热、止血、杀菌、镇痛等多种功能。目前在广西等地已有较大面积的亮叶杨桐的人工种植基地,但对其的开发利用仍然还仅限于初级茶叶加工。研究显示,亮叶杨桐叶中黄酮类化合物含量超过20%,主要包括山茶苷A、山茶苷B和芹菜素等,其中以山茶苷A的含量为最高。因此,从价廉易得的亮叶杨桐叶中制备高附加值的黄酮类化合物,可为深度开发和高效利用亮叶杨桐叶资源提供有益的参考,对于促进华南山区经济发展具有重要的现实意义。 采用高速逆流色谱法(HSCCC)对亮叶杨桐叶总黄酮提取物进行分离纯化。优化后的分离条件为,以乙酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)为两相溶剂体系(其中上相为固定相,下相为流动相),螺旋管转速900r/min,流动相流速2.0mL/min,温度25℃,检测波长280nm。以200mg样品溶于10mL下相溶剂进样,分离产物经真空浓缩、冷冻干燥,制备得到11.3mg山茶苷B和145.8mg山茶苷A。经HPLC-MS、UV、IR、NMR鉴定,该两种分离产物具有极高的纯度。 采用热提冷析的方法从亮叶杨桐叶中提取黄酮类物质,以响应面实验法对提取工艺条件进行优化,得到最佳提取工艺参数为:提取时间36min、液料比20、提取温度100℃。在该优化条件下,亮叶杨桐叶总黄酮的得率达到8.23%。其中,亮叶杨桐叶总黄酮提取物中山茶苷A的含量达到63.1%。 分别采用大孔吸附树脂法、水重结晶法和乙醇溶液重结晶法对山茶苷A进行纯化,并对其工艺进行优化。采用D101型大孔吸附树脂,以3.0mg/mL流速上样,以无水乙醇3.0mg/mL流速洗脱,最后经真空浓缩、干燥后,得到山茶苷A精制品的纯度达到91.7%,山茶苷A得率71.4%。以水重结晶5次后,山茶苷A纯度可达到97.8%,结晶产率为29.2%。以20%乙醇进行重结晶5次后,山茶苷A产品纯度达到98.2%,结晶产率32.8%。三种纯化方法中,采用20%乙醇重结晶法纯化山茶苷A的工艺具有操作简单、分离效率高、产品纯度高等优点,具有广阔的工业化应用前景。 采用不同方法(DPPH自由基清除试验、超氧阴离子清除试验、还原力测定以及亚油酸体系中抗氧化能力的测定)测定了山茶苷A、山茶苷B和芹菜素的抗氧化活性。结果显示,这三种黄酮类化合物均具有一定的抗氧化作用,并呈现出明显的剂量-效应关系。其中,山茶苷A和山茶苷B的抗氧化活性并无明显差异,但都明显强于芹菜素和染料木素。 采用MTT法对山茶苷A、山茶苷B和芹菜素的抗肿瘤活性进行了评价。结果显示,这三种黄酮类化合物对人表皮癌细胞A431和肺腺癌细胞A549都有良好的抑制作用,并呈现显著的时间-效应和剂量-效应关系。而且,三种物质对A431细胞的抑制作用,均明显其强于对A549细胞的抑制作用。其中,山茶苷A抑制肿瘤细胞的作用最强,其次是山茶苷B,芹菜素的作用最弱。 采用Rancimat法测定了15种天然黄酮类化合物在猪油体系中的抗氧化活性,并以量子化学方法计算其分子结构参数(包括△HOF、EHOMO、GAP、V、LogP、Dipole和NOH),通过主成分回归法进行统计分析,对其抗氧化活性进行定量构效关系(QSAR)研究。从而建立了黄酮类化合物抗油脂氧化活性与其分子结构参数之间构效关系模型:LgPF=2.998262—0.007691×△HOF+0.069501×EHOMO—0.249761×GAP—0.000269×V—0.130080×LogP—0.039331×Dipole+0.192317×NOH。此模型可用于预测与本研究相同体系的黄酮类化合物的抗氧化活性。
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