论文部分内容阅读
促性腺激素(Gonadotropin Hormone, GTH)是由脊椎动物垂体(Pituitary Gland, PG)前叶细胞合成与分泌的一类糖蛋白激素(Glycoprotein Hormones, GPHs),主要生理作用是刺激生殖细胞的生长、发育、成熟、排精及排卵。鱼类存在两种类型的GTHs,即GTHⅠ和GTHⅡ,分别对应于哺乳类的促卵泡素(Follicle-Stimulating Hormone, FSH)和促黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH), GTH是一个二聚体分子,由共同的含抗原决定因素的α亚基和激素生物学特异性的β亚基组成,两个亚基只有结合在一起才能发挥激素的生物学活性。鱼类的生殖周期主要由下丘脑-垂体-性腺轴调控,而垂体分泌的促性腺激素在鱼类的生殖周期调控中占据中心地位,是促进性腺发育与成熟的关键性激素。本研究选用草鱼(Grass carp, Ctenopharyngodon idella)作为实验材料,从草鱼脑垂体中提取总RNA,设计合成三对草鱼促性腺激素基因(GTHα、FSHβ和LHp)的特异性引物,RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)克隆得到编码草鱼促性腺激素基因的cDNA序列,它们的开放阅读框全长分别为357bp,393bp和441bp,分别编码118,130和146个氨基酸。选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTHα、FSHβ和LHβ的ORF序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3),在IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导下表达出3个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα、GST-FSHβ和GST-LHβ的表观分子量大约为35kDa、38kDa和39kDa。分别用抗GST标签的单克隆抗体对3个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确。利用制备型SDS-PAGE纯化、回收的蛋白分别免疫新西兰大白兔,制备了抗GTHα和抗FSHβ的两个具有较高效价的多克隆抗体。本研究首次选用融合表达载体pGEX-4T-1作为草鱼促性腺激素基因的原核表达工具,成功构建了重组GTH原核表达质粒,表达出草鱼重组促性腺激素。为进一步阐明促性腺激素在硬骨鱼类生殖周期调控中作用的分子机制、完善鱼类(特别是鲤科鱼类)的繁殖内分泌学研究具有重要的理论意义,而且在实践中可以为草鱼的人工繁殖提供一条新的催产途径,有重要的应用前景。