产几丁质酶渤海丝状真菌(Alternaria tenuissima)的筛选、鉴定及产酶研究

来源 :天津师范大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:gao1980623
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几丁质是β-(1,4)糖苷键聚合而成的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)聚合物,其存量仅次于木质纤维素。几丁质酶则是一类能将几丁质专一性降解为N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚N-乙酰胺基葡萄糖的水解酶。海洋环境中含有丰富的几丁质,为虾壳、蟹壳的主要成分,这些物质如果不经过处理,还有可能成为有机污染源,海洋的这种特殊生境,使得从海洋环境中分离筛选产几丁质酶真菌成为可能。本文以渤海湾水域获得的52株丝状海洋真菌为出发菌株,通过平版透明圈法和发酵液酶活性测定,从中筛选出一株产几丁质酶活力较高的海洋真菌MTJ04-1-1,进而以几丁质酶活性为指标对碳源、氮源、初始pH、培养温度和时间、装瓶量等因素进行条件优化,通过正交试验对产酶的最佳发酵条件进行了探索,并对MTJ-04-1-1菌株产几丁质酶酶学性质进行了初步的研究,分离得到的MTJ-04-1-1菌株,采用经典分类指标和18SrDNA-ITS序列分析相结合的方法对其进行了种属鉴定,结果如下:1)通过刚果红-几丁质平板透明圈法和发酵液几丁质酶活性测定法对产几丁质酶菌株进行筛选,并从中筛选出产几丁质酶活力较高的海洋真菌MTJ04-1-1。2)通过以几丁质酶活性为指标对碳源、氮源、初始pH、培养温度和时间、装瓶量等因素的分析,以及产酶的最佳发酵条件的正交试验,得到的最佳合成培养基发酵条件为:碳源:胶体几丁质1%(W/V),N源:硝酸铵,初始pH7.0,温度26℃,培养时间120h,装液量150ml(500ml三角瓶),接利,量为2%(孢子液浓度为107/mL),转速150r/min。3)粗酶液经80%硫酸铵沉淀透析脱盐后,酶的比活力达到844.86U/mg,纯化倍数达到1.27。4) PAGE活性电泳结果显示:分离得到的几丁质酶为复合酶,至少含有3种酶;进一步进行SDS-PAGE变性电泳,得到六条主带,分子量在33.0~94.0kD范围内,与文献记录的真菌几丁质酶分子量范围(20~100kD)相一致。5)分别对胞外和胞内几丁质酶酶学性质分析结果表明:胞外几丁质酶在pH6-8显示出较高活性,最适pH为6.5;该酶在30~50℃范围内显示出较高的活性,最适反应温度为45℃,50℃时酶活仍保留95%的活性,因此,MTJ04-1-1所产的几丁质酶具有中性偏碱的属性,且反应温度范围较宽。胞内几丁质酶的最适pH同样为6.5,不同的是,在pH6.5~8.0之间,酶活性随pH升高而明显下降,pH8.0时,酶活性仅存6.60%,表明该酶不具有碱性酶的特性:此外,该酶仅在25~35℃范围内有较好的活性表现,最适反应温度为30℃,随着温度增加,酶活性下降,50℃时酶活性仅保留15.1%的活性。6)菌种鉴定:对TJ04-1-1菌株进行经典分类指标的观察结果表明,该菌具有链格孢菌的特性。将该菌株的ITS序列提交到Gen-Bank数据库进行BLAST比对,结果表明:该菌株ITS序列与Alternaria tenuissima (GenBank:JF835819.1; EU816392.1)和Alternaria alternate (EU807867.1)等相似度为99%。依据形态学鉴定结果,结合菌种来源和优先原则,将该菌株鉴定为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima MTJ04-1-1).
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