寒冷环境暴露对于军队的战斗力可以产生显著的影响。在世界军事史上,诸多著名的冬季战例表明,寒冷可能成为决定一场战争走向的关键。所以,寒冷环境对军队战斗力的影响是军事医学研究中必须十分关注的因素。我国的寒区面积广大,约有1/3的国土面积、超过1/2的陆地边界位于寒冷地区,生活着我国近50%的人口和三分之二的驻军,战略意义十分重要。而寒冷气候严重影响了边防部队及驻军平战时的作训能力。为保障和提高寒区部队的适应能力和作战能力,研究提高寒区军事作业能力的医学保障措施具有重要的军事意义。寒冷可诱导机体产生一系列的特异性或非特异性生物学效应,长时间过强的冷暴露可以对心血管系统、免疫系统、中枢神经系统以及骨关节系统产生不同程度的损害。肝脏是机体重要的能量代谢器官,在冷暴露状态下,肝脏可出现脂质过氧化反应增强、酶活性改变、肝糖元分解及糖元异生、免疫细胞活性下降等,提示冷暴露可以显著影响肝脏的功能,但是其分子机制目前尚不完全清楚。寒冷暴露时肝脏功能的调节对于寒冷的适应能力起到至关重要的作用。p21是一种重要的细胞周期调控蛋白,它参与细胞的生长、分化及死亡过程,在细胞的生理、病理过程中发挥重要的作用。因此,本实验通过体内和体外试验,观察冷暴露对肝细胞形态及细胞周期的影响,研究p21在寒冷诱导的细胞损伤中的作用及相关信好转导机制,为进一步探讨冷暴露过程中肝细胞的损伤机制、探讨卫生学防护措施提供研究基础和参考依据。【方法】1.以-15℃,每天6 h冷暴露方法建立冷暴露大鼠模型;用HE染色方法观察冷暴露不同时间大鼠肝脏的病理学改变;Western blot检测肝组织MAPKs信号分子的表达活化。2.以Chang liver细胞系为实验对象,4℃环境培养0 h-24 h建立冷暴露细胞模型;应用倒置显微镜、MTT方法、台盼蓝排斥试验观察冷暴露不同时间对细胞形态、生存活力的影响;用流式细胞仪分析冷暴露不同时间对细胞凋亡和细胞周期的影响;用Tunel检测凋亡试剂盒进一步确定冷暴露不同时间对细胞凋亡的影响;Western blot检测冷暴露对细胞周期相关蛋白、MAPKs信号信号通路相关蛋白的表达变化和mTOR信号通路相关蛋白的表达变化;分别使用阻断剂阻断JNK和mTOR通路后,流式细胞仪分析细胞周期的改变,并用Western blot检测细胞周期蛋白的表达变化。【结果】1.大鼠肝脏HE染色结果显示:随着冷暴露时间的延长,大鼠肝脏细胞结构的损伤程度逐渐加重;Western blot结果显示:随着冷暴露时间的延长,肝组织中JNK磷酸化水平明显增高,而ERK的磷酸化水平没有明显变化。2.细胞计数法、MTT方法、台盼蓝排斥试验的结果均显示:冷暴露后细胞生长增殖明显受到抑制,且存在时间依赖性。流式细胞仪检测细胞凋亡和Tunel检测凋亡试剂盒结果均显示:冷暴露没有引起Chang liver细胞的凋亡,Western blot结果显示在冷暴露反应中caspase-3的表达无显著变化。流式细胞仪检测细胞周期结果发现:冷暴露引起细胞周期S期的抑制,Westernblot的结果显示冷暴露时p21的表达降低,而JNK和mTOR2446的磷酸化水平增高。用JNK和mTOR的抑制剂作用细胞后发现,mTOR抑制剂可以部分地逆转冷暴露引起的细胞周期S期的抑制和p21水平的降低,而JNK抑制剂则无此作用。【结论】1.冷暴露可以引起大鼠肝脏细胞的损伤,提示长时间寒冷暴露可以引起肝脏的形态结构呈时间-依赖性的损伤,并可能导致其功能损害;冷暴露可诱导JNK的磷酸化水平呈时间-依赖性的增强,提示JNK信号通路的激活与肝脏的损伤可能存在一定的关系。而肝脏ERK信号通路可能没有参与肝脏冷暴露反应的过程。2.4℃环境培养Chang liver细胞时,细胞生长增殖抑制,但这种抑制作用可能不是通过诱导细胞凋亡引起的。同时我们发现冷暴露引起了细胞周期S期的抑制,这可能与细胞周期蛋白p21表达水平的降低有关。在这个过程中mTOR信号通路可能参与了细胞周期的调控过程。而JNK磷酸化水平的增高可能主要是一种应激反应性的变化,而与细胞周期没有明显的关系。