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脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）,又名呕吐毒素,是一种主要由禾谷镰刀菌产生的B型单端孢霉烯族真菌毒素。DON能污染饲料作物及其副产品,不仅影响农作物的产出与质量,甚至对人和动物产生广泛的毒性作用。动物在误食含DON的发霉饲料或食物后,能产生如腹泻、呕吐、胃肠道出血、厌食和体重减轻等一系列症状,这些症状与DON引起的肠道炎症相关,此外,研究报道了 DON能引发包括肝脏、脾脏和皮肤等多种外周器官以及中枢系统的炎性反应。炎性小体（Inflammasome）是细胞内由多种蛋白组成的复合体,在天然免疫防御过程中起重要的调节作用。在细胞识别多种病原体和危险信号后,三种炎性小体蛋白进行组装,其中的半胱氨酸蛋白酶pro-caspase-1的自体剪切活化,最终引起促炎因子白细胞介素Interleukin（IL）-1β的成熟与分泌,最终引发炎症。目前已有研究的炎性小体主要包括 NLRP1,NLRP3,NLRP6,NLRP7,NLRP12,NLRC4 和 AIM2,其中,在不同细胞系展开的关于NLRP3炎性小体的研究已有许多,K+外流、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的生成以及组织蛋白酶B（Cathepsin B）的释放是针对不同刺激的炎性小体活化过程中的重要环节。此外,Src-family激酶蛋白和P2X7R蛋白可能参与真菌毒素诱导的炎性小体活化过程。本试验旨在研究DON对小鼠巨噬细胞RAW 264.7中NLRP3炎性小体的活化作用以及DON诱导NLRP3炎性小体活化的机制。试验一 DON对小鼠巨噬细胞RAW264.7中NLRP3炎性小体活化的影响本部分试验旨在探究DON能否诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7中NLRP3炎性小体的活化及IL-1β的释放。选用DON刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞为炎症模型,首先选取不同浓度 DON（0.01,0.025,0.05,0.1,0.25,0.5 及 1 μg/mL）刺激细胞,采用 MTT法测定不同浓度DON对小鼠RAW264.7细胞活力的影响。结果表明:0.25～1 μg/mL浓度的DON能显著抑制细胞活力。后续试验分别用0.5和1 μg/mL的DON刺激细胞4 h,提取细胞内总RNA,用qRT-PCR法检测不同浓度DON对细胞内pro-caspase-1、NLRP3、ASC及pro-IL-1β mRNA含量的影响,结果显示DON刺激细胞4 h后细胞内NLRP3 及 pro-IL-1 β的 mRN 表达量均显著提高（p＜0.05）,而 pro-caspase-1 和 ASC mRNA表达量与对照组相比差异无统计学意义（p＞0.05）。再用1μg/mLDON分别刺激细胞 6 h 及 12 h,用 Western Blotting 法检测 NLRP3,pro-caspase-1,caspase-1,ASC和pro-IL-1β的蛋白表达量,结果表明炎性小体蛋白含量均显著提高（p＜0.05）。再用1μg/mL DON分别刺激细胞12 h、16 h和24 h,固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中IL-1β浓度,结果显示IL-1β浓度均显著增加。最后用siRNA试验验证DON是通过NLRP3炎性小体的活化而促进IL-1β的释放。本试验结果表明DON能通过诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7中NLRP3炎性小体的活化从而促使IL-1β的释放。试验二DON诱导小鼠RAW264.7中NLRP3炎性小体活化的机理研究本试验研究DON诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞中NLRP3炎性小体活化的机制。首先探究K+外流、ROS以及cathepsin B在NLRP3炎性小体活化过程中的作用,分别在细胞培养液中加入抗氧化剂BHA（10 μmol/L）、cathepsin B抑制剂CA-07-Me（10μmol/L）及 KCl（12.5,25 和 50 mmol/L）,预处理细胞 30min,再加入 1μg/mL 的 DON共刺激24h,ELISA检测细胞培养上清中IL-1β含量。结果显示,加入抑制剂后,IL-1β含量与毒素对照组相比显著降低（p＜0.05）。此外,再研究Src-family激酶与P2X7R信号通路是否参与NLRP3炎性小体活化诱导的IL-1β释放这一过程中,首先分别检测DON刺激细胞后,P2X7R和磷酸化Src蛋白表达量变化,结果表明DON刺激细胞2h,能显著诱导P2X7R和磷酸化Src蛋白的表达。再分别用blue brillant G（BBG,20 μmol/L,P2X7R抑制剂）与PP2（5 μmol/L,Src-family激酶抑制剂）预处理细胞30 min,再加入1μg/mL DON共处理24 h,ELISA检测表明加入抑制剂后,细胞培养上清中IL-1β浓度与毒素对照组相比显著降低（p＜0.05）。再用siRNA试验验证结果。本试验结果表明K+外流、ROS生成、Cathepsin B的释放和Src-P2X7R途径在DON诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞中炎性小体的活化过程中起重要作用。