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第一部分CAFs在GC中的定位及临床意义
背景当今全球范围内胃癌(Gastric cancer, GC)仍然是一种生存率较差的恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤致死率排名中位列第三。由于缺乏特异性的诊断生物标志物和有效的抗癌治疗手段，GC患者的生存率普遍较低，其肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)的复杂性可能是导致预后较差的重要原因。GC细胞同所在的TME间存在彼此相互作用、相互影响的关系，在调控GC发生、发展的生物学过程中发挥了极其重要的作用。癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts, CAFs)是TME中最丰富的细胞成分，同样也是各种分泌分子的主要来源，对促进上皮细胞间质化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，进而对GC的发生、增殖、侵袭和转移、病理性血管生成、免疫逃逸以及耐药性产生均发挥着重要作用。现有的研究已证实，CAFs在多种类型的癌症(结肠癌，食道癌，乳腺癌和肝癌)中的组织学上表达量的增加与患者不良预后显著相关，而CAFs在GC中的表达情况及其与GC患者预后的关系却鲜有报道。CAFs在GC发生发展中扮演着重要角色，研究其在GC中的分布及其作用，有助于了解GC的发生发展机制，为GC的诊断和治疗提供参考。
方法收集了227例GC病例，运用免疫组化和免疫荧光方法研究CAFs在GC组织标本中的定位和表达情况，进而利用SPSS19.0软件分析CAFs特异性标志物α-SMA的表达水平与对应的GC患者临床病例特征及患者无病生存期(Disease Free Survival, DFS)和疾病特异性生存期(Disease Free Survival, DSS)之间的关系。
结果GC组织中α-SMA表达阳性的CAFs免疫组化和免疫荧光均显示：CAFs是一类排列杂乱、大小不一的多边形或梭形细胞，并且在GC患者胃组织中广泛分布，主要集中在肿瘤的间质组织内。GC组织中CAFs数量与GC患者的TNM分期(P=0.001)和神经侵犯(P=0.014)相关，与患者年龄、性别、ASA评分、BMI、肿瘤部位、肿瘤直径、脉管侵润、Lauren分型、分化程度和术后辅助化疗无关。单因素分析表明：年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、TNM分期、Lauren分型、α-SMA高表达和术后辅助化疗与GC的DFS均相关(P<0.05)，而性别、ASA评分、BMI、分化程度、脉管侵润和神经侵犯均与GC的DFS无关(P>0.05)。年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、TNM分期、Lauren分型、脉管侵润和神经侵犯、α-SMA高表达和术后辅助化疗与GC的DSS均相关(P<0.05)，而性别、ASA评分、BMI、分化程度与GC的DSS均无相关性(P>0.05)。多因素分析结果显示：TNM分期(P<0.001)、α-SMA高表达(P=0.009)和术后辅助化疗(P=0.001)是影响GC患者DFS的独立危险因素。TNM分期(P<0.001)、α-SMA高表达(P=0.008)和术后辅助化疗(P=0.003)是影响GC患者DSS的独立危险因素。
结论
1.CAFs主要分布于GC细胞外间质中，且CAFs数量与GC患者TNM分期和神经侵犯显著相关；
2.α-SMA高表达、TNM分期和术后辅助化疗均是影响GC患者DFS的独立危险因子；
3.α-SMA高表达、TNM分期和术后辅助化疗是影响GC患者DSS的独立危险因素。
第二部分CAFs通过分泌IL-17A激活JAK2/STAT3信号通路促进GC细胞的迁移和侵袭
背景肿瘤复发、转移导致恶性肿瘤死亡的主要原因。已有研究者报道CAFs在参与重塑肿瘤间质的过程中，构成了肿瘤细胞后期发生侵袭和转移的先决条件。GC中的CAFs与多种MicroRNA相互作用，通过激活一系列信号通路，进而调控下游靶基因的表达，最终促进GC细胞发生侵袭和转移。目前研究者发现IL-17A在肿瘤发生发展中可能具有双面性，其相关机制有待进一步研究证实。而在GC中，与正常对照组相比，GC患者的血清和肿瘤组织中IL-17表达水平均明显升高。也有研究发现，IL-17A和IL-17F不仅在GC组织中的表达水平高于正常组织，还能够促进GC细胞的增殖。然而IL-17A在GC细胞的发生、发展过程中的具体作用的分子机制尚不明确。CAFs能够分泌多种细胞因子并激活多种信号通过路，进而促进肿瘤发生发展。然而在GC中，CAFs能否分泌产生IL-17A且在GC进展中的具体作用机制却未见相关文献报道。
方法用免疫组化和免疫荧光法分析GC组织中α-SMA阳性CAFs与IL-17A阳性细胞之间的关系。通过ELISA法检测胃细胞，癌旁组织分离的成纤维细胞(Normal fibroblasts NFs)、CAFs、GC细胞与CAFs共培养体系中各细胞系中IL-17A的表达水平，用QRT-PCR检测GC细胞系，GC组织分离的CAFs，共培养后CAFs和GC细胞系中的IL-17AmRNA的表达水平。采用JAK2阻断剂AG490和IL-17A中和抗体分别干预Transwell迁移/侵袭小室，探索CAFs对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。通过JAK2阻断剂AG490和IL-17A中和抗体分别干预Transwell细胞共培养小室，探索CAFs和IL-17A对GC细胞JAK2/STAT3信号通路的影响，继续应用Westernblot法检测GC细胞EMT相关标志物(MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2)和STAT3信号通路标志蛋白(pJAK2、JAK2、pSTAT3和STAT3)表达的情况。
结果免疫组化及免疫荧光染色法对IL-17A在GC组织内的定位研究发现α-SMA阳性表达的CAFs和IL-17A表达阳性细胞主要定位于GC间质组织内，共同出现在GC间质的相同部位。ELISA结果发现胃细胞系GES-1、GC细胞系AGS和SGC7901可分泌产生IL-17A，但含量偏低，而GC组织中分离的CAFs分泌产生IL-17A能力明显高于癌旁组织中分离的NFs，二者差异具有统计学意义(P<0.05)；而CAFs与GC细胞AGS和SGC7901共培养体系则能够分泌产生更高含量的IL-17A(P<0.05)。QRT-PCR结果发现：共培养后分离出GC细胞系AGS和SGC7901的IL-17A的mRNA表达水平较单独培养GC细胞系的IL-17A的mRNA表达水平轻度升高，二者差异无统计学意义。与单独培养CAFs相比较，共培养后分离出CAFs的IL-17AmRNA表达水平显著增高，二者具有显著性差异(P<0.001)。
CAFs与GC细胞共培养后进行Transwell侵袭试验，两种GC细胞系AGS和SGC7901的迁移和侵袭能力均得到显著提高(P<0.05)。向共培养体系中加入IL-17A的中和抗体后，两种GC细胞迁移和侵袭能力则明显降低(P<0.05)。
CAFs与GC细胞系共培养后，提取相关细胞进行Westernblot试验检测，结果显示：CAFs能够提高AGS和SGC7901中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白pJAK2和pSTAT3的表达(P<0.05和P<0.05)，对JAK2和STAT3的表达无明显影响。向GC细胞(AGS和SGC7901)和CAFs的Transwell共培养体系中加入JAK2抑制剂AG490后，结果显示AG490能够抑制STAT3信号通路道白相关蛋白pJAK2和pSTAT3的表达(P<0.05和P<0.05)，而对JAK2和STAT3的表达无明显影响。再向GC细胞AGS和SGC7901和CAFs的Transwell共培养体系中加入细胞因子IL-17A的中和抗体后，结果显示IL-17A的中和抗体同样能够抑制STAT3信号通路道相关蛋白pJAK2和pSTAT3的表达(P<0.05和P<0.05)，而对JAK2和STAT3的表达无明显影响。
CAFs与GC细胞共培养体系中对GC细胞AGS和SGC7901进行Westernblot试验检测，结果显示：MMP-2和MMP-9的表达上调(P<0.05，P<0.05)，而TIMP-1和TIMP-2的表达显著下降(P<0.05，P<0.05)。而加入JAK2的抑制剂AG490后则能够显著影响GC细胞EMT相关标志物表达，GC细胞AGS和SGC7901TIMP-1和TIMP-2的表达上调(P<0.05，P<0.05)，而MMP-2和MMP-9的表达则显著下降(P<0.05，P<0.05)。当再向CAFs和GC细胞AGS、SGC7901共培养体系中加入IL-17A的中和抗体用以中和IL-17A后，同样发现GC细胞AGS和SGC7901中TIMP-1和TIMP-2的表达水平升高(P<0.05，P<0.05)，MMP-2和MMP-9的表达水平则显著下降(P<0.05，P<0.05)。在细胞水平，当向Transwell侵袭小室中加入转录因子JCK2的抑制剂AG490后，GC细胞AGS和SGC7901的迁移和侵袭能力(P<0.001，P<0.05)也明显降低。
结论
1.CAFs可能是GC组织中分泌产生IL-17A的主要来源；
2.CAFs能够提高GC细胞的迁移和侵袭能力；
3.CAFs可能是通过IL-17A激活JAK2/STAT3信号通路，促进GC细胞迁移和侵袭；
4.CAFs能够促进GC细胞的EMT，提高GC细胞侵袭和迁移能力。
背景当今全球范围内胃癌(Gastric cancer, GC)仍然是一种生存率较差的恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤致死率排名中位列第三。由于缺乏特异性的诊断生物标志物和有效的抗癌治疗手段，GC患者的生存率普遍较低，其肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)的复杂性可能是导致预后较差的重要原因。GC细胞同所在的TME间存在彼此相互作用、相互影响的关系，在调控GC发生、发展的生物学过程中发挥了极其重要的作用。癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts, CAFs)是TME中最丰富的细胞成分，同样也是各种分泌分子的主要来源，对促进上皮细胞间质化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，进而对GC的发生、增殖、侵袭和转移、病理性血管生成、免疫逃逸以及耐药性产生均发挥着重要作用。现有的研究已证实，CAFs在多种类型的癌症(结肠癌，食道癌，乳腺癌和肝癌)中的组织学上表达量的增加与患者不良预后显著相关，而CAFs在GC中的表达情况及其与GC患者预后的关系却鲜有报道。CAFs在GC发生发展中扮演着重要角色，研究其在GC中的分布及其作用，有助于了解GC的发生发展机制，为GC的诊断和治疗提供参考。
方法收集了227例GC病例，运用免疫组化和免疫荧光方法研究CAFs在GC组织标本中的定位和表达情况，进而利用SPSS19.0软件分析CAFs特异性标志物α-SMA的表达水平与对应的GC患者临床病例特征及患者无病生存期(Disease Free Survival, DFS)和疾病特异性生存期(Disease Free Survival, DSS)之间的关系。
结果GC组织中α-SMA表达阳性的CAFs免疫组化和免疫荧光均显示：CAFs是一类排列杂乱、大小不一的多边形或梭形细胞，并且在GC患者胃组织中广泛分布，主要集中在肿瘤的间质组织内。GC组织中CAFs数量与GC患者的TNM分期(P=0.001)和神经侵犯(P=0.014)相关，与患者年龄、性别、ASA评分、BMI、肿瘤部位、肿瘤直径、脉管侵润、Lauren分型、分化程度和术后辅助化疗无关。单因素分析表明：年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、TNM分期、Lauren分型、α-SMA高表达和术后辅助化疗与GC的DFS均相关(P<0.05)，而性别、ASA评分、BMI、分化程度、脉管侵润和神经侵犯均与GC的DFS无关(P>0.05)。年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、TNM分期、Lauren分型、脉管侵润和神经侵犯、α-SMA高表达和术后辅助化疗与GC的DSS均相关(P<0.05)，而性别、ASA评分、BMI、分化程度与GC的DSS均无相关性(P>0.05)。多因素分析结果显示：TNM分期(P<0.001)、α-SMA高表达(P=0.009)和术后辅助化疗(P=0.001)是影响GC患者DFS的独立危险因素。TNM分期(P<0.001)、α-SMA高表达(P=0.008)和术后辅助化疗(P=0.003)是影响GC患者DSS的独立危险因素。
结论
1.CAFs主要分布于GC细胞外间质中，且CAFs数量与GC患者TNM分期和神经侵犯显著相关；
2.α-SMA高表达、TNM分期和术后辅助化疗均是影响GC患者DFS的独立危险因子；
3.α-SMA高表达、TNM分期和术后辅助化疗是影响GC患者DSS的独立危险因素。
第二部分CAFs通过分泌IL-17A激活JAK2/STAT3信号通路促进GC细胞的迁移和侵袭
背景肿瘤复发、转移导致恶性肿瘤死亡的主要原因。已有研究者报道CAFs在参与重塑肿瘤间质的过程中，构成了肿瘤细胞后期发生侵袭和转移的先决条件。GC中的CAFs与多种MicroRNA相互作用，通过激活一系列信号通路，进而调控下游靶基因的表达，最终促进GC细胞发生侵袭和转移。目前研究者发现IL-17A在肿瘤发生发展中可能具有双面性，其相关机制有待进一步研究证实。而在GC中，与正常对照组相比，GC患者的血清和肿瘤组织中IL-17表达水平均明显升高。也有研究发现，IL-17A和IL-17F不仅在GC组织中的表达水平高于正常组织，还能够促进GC细胞的增殖。然而IL-17A在GC细胞的发生、发展过程中的具体作用的分子机制尚不明确。CAFs能够分泌多种细胞因子并激活多种信号通过路，进而促进肿瘤发生发展。然而在GC中，CAFs能否分泌产生IL-17A且在GC进展中的具体作用机制却未见相关文献报道。
方法用免疫组化和免疫荧光法分析GC组织中α-SMA阳性CAFs与IL-17A阳性细胞之间的关系。通过ELISA法检测胃细胞，癌旁组织分离的成纤维细胞(Normal fibroblasts NFs)、CAFs、GC细胞与CAFs共培养体系中各细胞系中IL-17A的表达水平，用QRT-PCR检测GC细胞系，GC组织分离的CAFs，共培养后CAFs和GC细胞系中的IL-17AmRNA的表达水平。采用JAK2阻断剂AG490和IL-17A中和抗体分别干预Transwell迁移/侵袭小室，探索CAFs对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。通过JAK2阻断剂AG490和IL-17A中和抗体分别干预Transwell细胞共培养小室，探索CAFs和IL-17A对GC细胞JAK2/STAT3信号通路的影响，继续应用Westernblot法检测GC细胞EMT相关标志物(MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2)和STAT3信号通路标志蛋白(pJAK2、JAK2、pSTAT3和STAT3)表达的情况。
结果免疫组化及免疫荧光染色法对IL-17A在GC组织内的定位研究发现α-SMA阳性表达的CAFs和IL-17A表达阳性细胞主要定位于GC间质组织内，共同出现在GC间质的相同部位。ELISA结果发现胃细胞系GES-1、GC细胞系AGS和SGC7901可分泌产生IL-17A，但含量偏低，而GC组织中分离的CAFs分泌产生IL-17A能力明显高于癌旁组织中分离的NFs，二者差异具有统计学意义(P<0.05)；而CAFs与GC细胞AGS和SGC7901共培养体系则能够分泌产生更高含量的IL-17A(P<0.05)。QRT-PCR结果发现：共培养后分离出GC细胞系AGS和SGC7901的IL-17A的mRNA表达水平较单独培养GC细胞系的IL-17A的mRNA表达水平轻度升高，二者差异无统计学意义。与单独培养CAFs相比较，共培养后分离出CAFs的IL-17AmRNA表达水平显著增高，二者具有显著性差异(P<0.001)。
CAFs与GC细胞共培养后进行Transwell侵袭试验，两种GC细胞系AGS和SGC7901的迁移和侵袭能力均得到显著提高(P<0.05)。向共培养体系中加入IL-17A的中和抗体后，两种GC细胞迁移和侵袭能力则明显降低(P<0.05)。
CAFs与GC细胞系共培养后，提取相关细胞进行Westernblot试验检测，结果显示：CAFs能够提高AGS和SGC7901中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白pJAK2和pSTAT3的表达(P<0.05和P<0.05)，对JAK2和STAT3的表达无明显影响。向GC细胞(AGS和SGC7901)和CAFs的Transwell共培养体系中加入JAK2抑制剂AG490后，结果显示AG490能够抑制STAT3信号通路道白相关蛋白pJAK2和pSTAT3的表达(P<0.05和P<0.05)，而对JAK2和STAT3的表达无明显影响。再向GC细胞AGS和SGC7901和CAFs的Transwell共培养体系中加入细胞因子IL-17A的中和抗体后，结果显示IL-17A的中和抗体同样能够抑制STAT3信号通路道相关蛋白pJAK2和pSTAT3的表达(P<0.05和P<0.05)，而对JAK2和STAT3的表达无明显影响。
CAFs与GC细胞共培养体系中对GC细胞AGS和SGC7901进行Westernblot试验检测，结果显示：MMP-2和MMP-9的表达上调(P<0.05，P<0.05)，而TIMP-1和TIMP-2的表达显著下降(P<0.05，P<0.05)。而加入JAK2的抑制剂AG490后则能够显著影响GC细胞EMT相关标志物表达，GC细胞AGS和SGC7901TIMP-1和TIMP-2的表达上调(P<0.05，P<0.05)，而MMP-2和MMP-9的表达则显著下降(P<0.05，P<0.05)。当再向CAFs和GC细胞AGS、SGC7901共培养体系中加入IL-17A的中和抗体用以中和IL-17A后，同样发现GC细胞AGS和SGC7901中TIMP-1和TIMP-2的表达水平升高(P<0.05，P<0.05)，MMP-2和MMP-9的表达水平则显著下降(P<0.05，P<0.05)。在细胞水平，当向Transwell侵袭小室中加入转录因子JCK2的抑制剂AG490后，GC细胞AGS和SGC7901的迁移和侵袭能力(P<0.001，P<0.05)也明显降低。
结论
1.CAFs可能是GC组织中分泌产生IL-17A的主要来源；
2.CAFs能够提高GC细胞的迁移和侵袭能力；
3.CAFs可能是通过IL-17A激活JAK2/STAT3信号通路，促进GC细胞迁移和侵袭；
4.CAFs能够促进GC细胞的EMT，提高GC细胞侵袭和迁移能力。