论文部分内容阅读
目的:1.建立并鉴定hUCMSCs细胞缺氧/复氧模型,检测缺氧/复氧对hUCMSCs细胞增殖和凋亡的影响,检测HNPG对缺氧/复氧hUCMSCs细胞模型损伤的逆转作用,并探究其可能的分子生物学机制。2.建立并鉴定模拟妊娠、难产产伤、卵巢去势综合致病SD大鼠SUI模型,探究其发生的可能分子生物学机制。3.采用hUCMSCs细胞移植治疗SD大鼠SUI模型,检测hUCMSCs细胞移植治疗的作用,检测HNPG对hUCMSCs细胞移植治疗SD大鼠SUI模型的促进作用,并探究其可能的分子生物学机制。方法:1.采用Na2S2O4体外建立缺氧/复氧hUCMSCs细胞模型并鉴定,采用siRNA技术沉默ER-β基因,建立hUCMSCsER-βsiRNA细胞模型并鉴定,实验分为Control组、Na2S2O4组、E2组、HNPG组、PHTPP组和ER-βsiRNA组;采用MTT检测细胞增殖率,FCM检测细胞周期、凋亡率、活性氧、线粒体膜电位,ELISA检测细胞SOD和CAT活力以及GSH和MDA含量,RT-qPCR和western blotting检测细胞ER-β、β-catenin、cyclin D1、bcl-2、bax、caspase-3mRNA和蛋白表达。2.采用模拟妊娠、难产产伤、卵巢去势建立综合致病SD大鼠SUI模型,采用喷嚏实验检测其临床指标,采用MBC、LPP和ALPP检测其尿动力学指标,采用HE染色和Masson染色检测其尿道括约肌组织病理学指标,采用ELISA检测其尿道括约肌细胞SOD和CAT活力及GSH和MDA含量,RT-qPCR和western blotting检测其尿道括约肌细胞ER-β、cyclin D1、β-catenin、bcl-2、bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达。3.采用hUCMSCs细胞移植治疗SD大鼠SUI模型,实验分为Control组、SUI组、hUCMSCs组、E2组、HNPG组、PHTPP组和ER-βsiRNA组;采用喷嚏实验检测其临床指标,采用MBC、LPP和ALPP检测其尿动力学指标,采用HE染色和Masson染色检测其尿道括约肌组织病理学指标,采用ELISA检测其尿道括约肌细胞SOD和CAT活力及GSH和MDA含量,RT-qPCR和western blotting检测其尿道括约肌细胞ER-β、β-catenin、cyclin D1、bcl-2、bax、caspase-3、α-SMA、calponin、SM-MHC mRNA和蛋白表达。结果:1.Na2S2O4在体外可以诱导建立hUCMSCs细胞缺氧/复氧模型,体外构建pSilencer 3.1-H1neo-ER-β重组质粒并稳定转染hUCMSCs细胞,经Na2S2O4诱导的hUCMSCs细胞缺氧/复氧模型增殖受到抑制,细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡率增高,细胞ROS含量增高,而细胞SOD和CAT活力下降,细胞GSH含量下降,细胞MDA含量升高,细胞MMP下降,细胞ER-β、cyclin D1和bcl-2 mRNA和蛋白表达下降,而细胞bax和caspase-3 mRNA和蛋白表达上升。HNPG可以显著逆转Na2S2O4诱导的hUCMSCs细胞缺氧/复氧模型的增殖抑制,降低细胞G1期比例、细凋亡率、细胞ROS含量,提高细胞SOD和CAT活力以及GSH含量,降低细胞MDA含量,上调细胞ER-β、β-catenin、cyclin D1和bcl-2 mRNA和蛋白表达,下调细胞bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达。而PHTPP和ER-βsiRNA可以阻断HNPG对hUCMSCs细胞缺氧/复氧模型的逆转效应。2.采用模拟妊娠、难产产伤、卵巢去势综合致病可成功获得SD大鼠SUI模型,临床指标喷嚏实验呈阳性表现,尿动力学指标MBC、LPP和ALPP参值显著降低,尿道括约肌组织病理学指标HE染色和Masson染色显示细胞数量和细胞核数量显著减少,肌层和胶原纤维层变薄、染色变浅、间隙变宽、排列紊乱,出现断裂现象,有团灶状分布,失去正常的组织结构,ELISA检测提示其尿道括约肌细胞SOD和CAT活性降低,GSH含量降低,而MDA含量增高,RT-qPCR和western blotting检测ER-β、β-catenin、cyclin D1、bcl-2mRNA和蛋白表达降低,而bax和caspase-3 mRNA和蛋白表达上调。3.采用hUCMSCs细胞移植治疗SD大鼠SUI模型,可以显著降低其临床指标喷嚏实验阳性率、提升尿动力学指标MBC、LPP和ALPP参值,显著改善尿道括约肌组织病理学特征。HNPG可以促进hUCMSCs细胞移植治疗SD大鼠SUI模型的治疗作用,其机制可能与其降低其尿道括约肌细胞ROS含量,提高SOD和CAT活力以及GSH含量,降低MDA含量,上调ER-β、β-catenin、cyclin D1、bcl-2、α-SMA、calponin、SM-MHC mRNA和蛋白表达,下调bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达相关。而PHTPP和ER-βsiRNA可以阻断HNPG对hUCMSCs细胞移植治疗SD大鼠SUI模型的逆转作用。结论:1.Na2S2O4体外可以诱导建立hUCMSCs细胞缺氧/复氧模型,而HNPG具有逆转Na2S2O4对hUCMSCs细胞损伤作用,其机制可能与HNPG激活细胞ER-β和wnt信号通路,促进细胞增殖,上调抗氧化酶系,抑制氧化应激反应,抑制细胞线粒体途径凋亡相关。2.模拟妊娠、难产产伤、卵巢去势综合致病可建立SD大鼠SUI模型,其机制可能与尿道括约肌细胞ER-β和wnt信号通路抑制,细胞增殖抑制,氧化应激反应增强,细胞线粒体途径凋亡激活相关。3.hUCMSCs细胞移植可以显著改善SD大鼠SUI综合致病模型的临床症状。而HNPG对hUCMSCs细胞移植治疗SD大鼠SUI模型有显著的促进作用,HNPG可以显著降低喷嚏实验阳性率,逆转模型鼠尿动力学指标MBC、LPP和ALLP参值,改善尿道括约肌组织病理学特征,其机制可能与HNPG激活hUCMSCs细胞ER-β信号通路,调节ER-β表达,抑制氧化应激反应,抑制细胞凋亡,促进细胞肌分化相关。