【研究背景】慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是血液系统常见的恶性肿瘤之一。化疗仍然是治疗白血病的主要手段,其副作用及临床耐药已成为化疗的主要障碍。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors, TKI)的出现是内科治疗CML的新的里程碑,但是由于基因变异引起的耐药现象也日见增多,因此寻找针对CML更有效、毒副反应更少的药物是临床治疗迫切需要解决的问题之一。传统中药治疗肿瘤由来已久。现代中医学认为肿瘤的病机多为“热毒”、“瘀血”、“瘀毒”等,从近几十年来所取得的成果来看,砷剂(雄黄)、苦参碱(苦参)、靛玉红(青黛)等均作为“以毒攻毒”、“清热解毒”、“活血化瘀”的药物而被应用于中医临床,并取得显著疗效。目前,用现代化的科学技术,对传统中草药进行大力开发,对其药理学作用给予新的理解和阐述,致力于研究开发出新的抗癌药物,来大力弘扬祖国传统医学,已成为当前中医药研究的发展趋势。现代研究证实中药治疗白血病的作用可表现在以下几方面：直接诱导细胞凋亡,一定程度逆转白血病多药耐药,增加患者免疫力,减轻化疗副作用等。白血病与凋亡关系密切,利用凋亡机制清除白血病细胞引发出白血病治疗的新观念、新手段。中药可通过多种途径诱导白血病细胞凋亡,包括直接杀伤、细胞周期阻滞、影响凋亡基因表达、诱导分化、提高细胞因子及体内激素水平等。现代药理研究表明穿山甲对肿瘤的影响包括一定程度抑制肿瘤生长,使T细胞亚群、NK细胞活性增高,提高晚期癌症患者生存质量及免疫功能,减少患者恶心呕吐、白细胞减少、血小板减少等化疗副作用。临床研究用于治疗肺癌、乳腺癌、白血病等恶性肿瘤均有报道。但临床使用穿山甲时,多与其他中药配伍使用,单用或提取成分应用较少,而且对慢性粒细胞白血病的作用及作用机制的报道目前仍未见。本研究进一步验证穿山甲蛋白提取物的体外抗白血病疗效,为穿山甲的临床使用奠定实验基础。【研究目的】为进一步验证穿山甲对白血病的抗肿瘤作用,以慢性髓细胞性白血病K562细胞株为研究对象,观察穿山甲蛋白提取物对K562细胞的生长增殖及凋亡的影响,探讨穿山甲诱导K562细胞凋亡可能的作用机制。【研究方法】1.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测K562细胞增殖。2. Hoechst 33258荧光染色法观察K562细胞凋亡的形态变化。3.流式细胞仪检测K562细胞的凋亡率,验证穿山甲蛋白提取物诱导K562细胞凋亡的作用。【研究结果】1.MTT实验观察穿山甲蛋白提取物对K562细胞生长及增殖的影响各浓度穿山甲蛋白提取物对K562细胞的增殖有不同程度的抑制作用,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01),且在一定剂量范围内,随穿山甲蛋白提取物浓度的增加,其抑制率越来越高,具有明显的剂量依赖性；24小时IC50是12.07ug／ml；提取液本身有一定促凋亡作用,但与一定浓度穿山甲蛋白提取物相比,差异有统计学意义(P<0.05)。2. Hoechst 33258荧光染色法观察K562细胞的形态变化20μg／ml剂量的穿山甲蛋白提取物作用K562细胞48 h后在镜下可见细胞皱缩、变形,染色质凝聚且边缘化,部分细胞体积变小并呈现DNA荧光碎片或出现浓染致密的块状和颗粒状强荧光。3.流式细胞术分析细胞凋亡Annexin V-PI双染色法检测结果显示未加药组、单纯提取液组、穿山甲蛋白提取物组48小时凋亡率分别是(3.42±0.69)%、(35.32±1.45)%、(49.04±1.84)%,穿山甲蛋白提取物组凋亡率高于阴性对照组和单纯提取液组(P<0.05)。穿山甲蛋白提取物组与单纯提取液组的坏死率无显著差异。【结论】1.不同浓度穿山甲蛋白提取物能够不同程度抑制K562细胞增殖,并且抑制率呈明显的剂量-效应关系。2. Hoechst 33258荧光染色法显示穿山甲蛋白提取物能够诱导细胞凋亡,呈特征性的细胞凋亡形态。3. Annexin-PI双染色法检测凋亡率进一步证实了穿山甲蛋白提取物诱导K562细胞凋亡的作用。