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程序性细胞死亡受体1(Program cell death 1,PD-1),及其配体(PD-L1和PD-L2)介导的信号通路在调控机体免疫稳态,尤其是T细胞免疫应答和T细胞稳态中发挥重要作用。研究表明,PD-1/PD-L1/L2信号除参与自身免疫、慢性感染性疾病、器官移植免疫及肿瘤免疫外,还参与动脉粥样硬化的发生发展。T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白(T Cell Immunoglobulin Mucin,Tim)-3分子在T细胞功能性分化与免疫调节中发挥关键的调节作用,Tim-3缺陷表现为多种自身免疫性疾病、感染性疾病与肿瘤的发生。本课题首先将以Tim-3信号对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)功能及炎症反应的调节作用为切入点,一步以动脉粥样硬化患者为主要研究对象,分析各型免疫细胞上PD-1/Tim-3的表达,解析动脉粥样硬化病变动脉局部微环境对免疫细胞上PD-1/Tim-3表达的调节,阐明PD-1/Tim-3信号对AS患者免疫细胞功能的调控,进一步探讨PD-1/Tim-3信号对动脉粥样硬化发生发展的调节作用;为冠状动脉粥样硬化性心脏病、下肢动脉硬化闭塞症、缺血性脑卒中、主动脉夹层和腹主动脉瘤等疾患的防治提供新的思路。目的1.研究Tim-3信号对HUVEC凋亡、迁移及炎性反应的调节作用及其信号转导机制。2.研究PD-1/Tim-3信号在动脉粥样硬化中对CD4~+T、CD8~+T细胞表型和功能的调节作用。方法1.Annexin V-FITC、核染色及active casepase-3检测法分析细胞凋亡、划痕试验、流式细胞术检测细胞因子表达分别分析Tim-3信号对HUVEC增殖、凋亡、侵袭及炎性反应的影响。In-cell western检测Tim-3活化的胞内信号通路分子,相应的信号通路抑制剂阻断Tim-3的活化效应。2.流式细胞术分析动脉粥样硬化患者及健康志愿者外周血及动脉粥样硬化局部动脉血中各免疫细胞亚群上PD-1/Tim-3的表达;流式细胞术分析不同CD4~+T、CD8~+T细胞亚群的表型、细胞因子、转录因子的表达;给予Tim-3和PD-1中和性抗体,流式细胞术分析CD4~+T细胞胞内细胞因子和相关转录因子的表达特征。结果1.ox-LDL可诱导HUVEC凋亡并增加促炎细胞因子的表达;Tim-3可以直接促进HUVEC的增殖并增加抑炎因子的表达;对于ox-LDL诱导的HUVEC凋亡和炎症反应,Tim-3具有保护作用,抑制其Th1型细胞因子的产生并增加Th2型细胞因子的表达。对于ox-LDL诱导的HUVEC迁移抑制,Tim-3亦具有保护作用。同时Tim-3通过活化JNK信号通路减少ox-LDL引起的HUVEC凋亡;并抑制NF-κB信号通路降低HUVEC中炎症因子的产生。运用Tim-3中和性抗体拮抗Tim-3作用后,Tim-3对ox-LDL引起的HUVEC炎性反应的保护作用消失。2.动脉脉粥样硬化患者与健康志愿者外周血及动脉局部血各型免疫细胞均表达不同水的PD-1/Tim-3,PD-1~+Tim-3~+CD4~+T细胞在动脉粥样硬化患者中主要为中枢性记忆性T细胞,而健康志愿者中则大部分表现为效应性记忆性T细胞;在动脉粥样硬化患者中,相比较于PD-1~-Tim-3~-CD4~+T细胞,PD-1~+Tim-3~+CD4~+T细胞可以产生更多的抗动脉粥样硬化炎症因子,而促动脉粥样硬化炎症因子的表达明显减少。运用PD-1和Tim-3中和性抗体拮抗PD-1和Tim-3信号通路,单独及联合阻断PD-1/Tim-3信号后均能增加Th1型免疫反应细胞因子INF-γ、TNF-α及Th1型免疫反应关键转录因子T-bet的产生,同时减少Th2型免疫反应细胞因子IL-4、IL-10及Th2型免疫反应关键转录因子GATA-3的产生。3.动脉粥样硬化患者外周血及动脉局部血中PD-1~+Tim-3~+CD8~+T细胞比例增加,而PD-1~-Tim-3~-CD8~+T细胞数量减少。PD-1~+Tim-3~+CD8~+T细胞在动脉粥样硬化中多数为中枢性记忆性T细胞,这群细胞增殖活跃,并且可以产生更多的抗动脉粥样硬化炎症因子,同时促动脉粥样硬化炎症因子产生减少。运用PD-1和Tim-3中和性抗体拮抗PD-1和Tim-3信号通路,单独及联合阻断PD-1/Tim-3信号后均能减少Th2型细胞因子IL-10、IL-4及Th2型免疫反应关键转录因子GATA-3的产生,同时增加Th1型免疫反应细胞因子INF-γ、TNF-α及Th1型免疫反应关键转录因子T-bet的产生。结论1.ox-LDL可诱导血管内皮细胞凋亡,抑制血管内皮细胞迁移,促进血管内皮细胞的炎症反应,促进动脉粥样硬化的发生发展。而Tim-3信号可通过改善ox-LDL诱导的血管内皮的迁移抑制,抑制Th1型免疫反应,增加Treg细胞因子表达,促进局部Th2型免疫偏移,通过活化JNK信号通路抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞凋亡及炎症反应,从而发挥抗动脉粥样硬化作用。2.PD-1联合Tim-3信号可诱导CD4~+T细胞呈现免疫耐受表型,并参与建立动脉粥样硬化患者病变动脉局部Th2型免疫优势,调节CD4~+T细胞功能,抑制动脉粥样硬化的发生发展;阻断PD-1/Tim-3信号可导致CD4~+T细胞功能紊乱,促进动脉粥样硬化进展,加重动脉粥样硬化损伤。3.在动脉粥样硬化病变局部动脉中,共表达PD-1和Tim-3的CD8~+T细胞的数量上调,这一特殊类型CD8~+T细胞不仅仅是耗竭性的。动脉粥样硬化患者病变动脉局部动脉血中的PD-1~+Tim-3~+CD8~+T细胞产生更多的抗动脉粥样硬化细胞因子,阻断PD-1/Tim-3信号后可加重动脉粥样硬化的Th1型免疫反应,促进动脉粥样硬化进展。