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沼气技术由于可以利用多种多样的有机废弃物、生产清洁高效的沼气以及富含养分的沼肥,因而被世界各国广泛应用于环境污染、能源危机和农业可持续发展等问题的解决。但在高纬度地区和高原地区,低温是沼气大规模推广的主要限制因素;有研究表明我国75%以上的户用沼气池受到低温的影响;因而高效低温沼气技术的研究与设计成为关注的热点。由于沼气发酵是生物代谢的过程,因而其性能与微生物密切相关;众多研究人员对低温沼气发酵系统这一“灰箱”所蕴藏的微生物进行了深入的研究,并初步揭示了低温沼气发酵微生物的群落组成与功能;但在低温沼气发酵系统中,诸如微生物优势种群的演替(时间动态)、环境因子(生物因子和非生物因子)对微生物群落结构与多样性的影响、环境因子之间的相互关系等生态学基本问题,还不是很清楚,有待进一步研究、阐明。为此,本研究分别在15℃、9℃和4℃低温条件下驯化沼气发酵接种物;然后采用批量发酵工艺,将驯化得到的15℃低温接种物、9℃低温接种物和4℃低温接种物,分别接种至猪粪原料中,进行9℃低温发酵,形成3个低温沼气发酵系统(对应为A系统、B系统、C系统),并综合应用非生物因子分析法、生物因子分析法(16S rDNA扩增子测序)和SPSS相关性分析法,对供试低温沼气发酵系统中的微生物生态学基本问题进行研究,以期为优良低温沼气发酵微生物资源的挖掘和高效低温沼气发酵接种物的获得提供指导。结果显示:⑴A系统、B系统和C系统的沼气发酵时间分别为120 d、160 d及160 d;总产气量分别为68,650 m L、61,750 mL及19,150 m L,CH4产量分别为31,191 m L、20,906 mL及3,031 m L;A系统的总产气量分别是B系统和C系统的1.1倍和3.6倍,A系统的CH4产量分别是B系统和C系统的1.5倍和10.3倍。⑵A系统不同发酵时期的细菌OTU平均值和古菌OTU平均值分别为1,215个和787个,B系统的分别为968个和758个,C系统的分别为732个和720个;A系统的细菌OTU数目和古菌OTU数目分别是B系统的1.3倍和1.0倍,是C系统的1.7倍和1.1倍。⑶在门分类水平上,A系统、B系统和C系统的优势细菌门均为Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria和Synergistetes,优势古菌门均为Euryarchaeota、MCG、Thaumarchaeota和Woesearchaeota。在属分类水平上,A系统和B系统的优势水解细菌基本都为Clostridium、Streptococcus、Vibrio,优势的发酵产酸菌基本均为Terrisporobacter、Turicibacter、vadinBC27_wastewater-sludge_group,优势的产氢产乙酸菌为Syntrophomonas,优势的产甲烷菌为Methanobacterium和Methanocorpusculum;而在C系统中,优势的细菌属为Pseudomonas、Clostridium、Terrisporobacter,优势的古菌属为Methanosphaera。⑷在A系统中,Clostridium的相对丰度在发酵第60 d时达到最高峰,其后在发酵第90~100 d时再次达到高峰;Streptococcus的相对丰度在发酵第20 d时达到高峰;Vibrio的相对丰度最高峰出现在发酵第10 d;Turicibacter的相对丰度高峰主要出现在发酵第20 d和40 d时;Methanobacterium的相对丰度在发酵第20 d、50 d及70 d达到高峰。在B系统中,Clostridium的相对丰度最高峰出现在发酵第100 d时,次高峰出现在发酵第140~150 d;Streptococcus的相对丰度出现在发酵启动后至第30 d时;Terrisporobacter相对丰度的第一个高峰期在发酵启动后至第60 d之间,最高峰出现在发酵第110 d,次高峰在发酵第140 d时;Methanocorpusculum的相对丰度分别在发酵第30 d、50 d及150 d时达到高峰。得出的结论为:⑴在9℃低温沼气发酵环境中,15℃低温驯化接种物的产气性能明显优于9℃低温驯化接种物的,显著优于4℃低温驯化接种物的;分别采用15℃和9℃驯化接种物的低温沼气发酵系统能够正常运行,而采用4℃驯化接种物的低温沼气发酵系统的运行是失常的。⑵在运行正常的低温沼气发酵系统中,纤维素(半纤维素)水解菌、蛋白质水解菌和脂肪水解菌是优势的水解细菌,单糖分解菌和氨基酸分解菌是优势的发酵产酸细菌,氢营养型产甲烷菌是优势的产甲烷菌,这些沼气发酵微生物构成了稳定的低温沼气发酵食物链。在运行失常的低温沼气发酵系统中,水解发酵过程、产氢产乙酸过程和产甲烷过程均受到严重抑制;而反硝化细菌是该系统优势的细菌类群,系统所产气体以N2为主。⑶在运行正常的低温沼气发酵系统中,纤维素、半纤维素、蛋白质及脂肪等非水溶性大分子有机基质的水解顺序为脂肪>蛋白质>半纤维素>纤维素,即脂肪和蛋白质主要在发酵初期被水解,半纤维素主要在发酵中期被水解,纤维素的水解则发生在发酵末期;单糖发酵产酸菌的代谢高峰主要出现在发酵初期和中期;氢营养型产甲烷菌主要在发酵初期和中期大量活动。⑷综上所述,在15℃低温条件下驯化接种物,可获得耐冷、高效的沼气发酵微生物类群,为提高低温沼气发酵系统的效率提供了一条实用有效的理论与思路。