一、研究背景目前,在世界范围,胃癌(Gastric carcinoma, GC)占恶性肿瘤发生率的第五位及肿瘤导致死亡原因的第三位。胃癌每年全球的发病人数为1,000,000,其中70%以上发生在东亚国家。在我国,胃癌的发病率高达2.5/1000,占肿瘤导致死亡原因的23.2%,由于筛查手段的限制,在我国,超过60%的胃癌初次诊断已经处于进展期。传统的细胞毒性药物由于其毒副作用,对于进展期胃癌的治疗疗效已经达到瓶颈。近年来,随着分子生物学与免疫学的发展,分子靶向治疗已逐渐成为抗肿瘤治疗的有效手段。分子靶向治疗是针对肿瘤发生过程中的一系列分子事件,运用单克隆抗体或小分子药物等,阻断癌细胞异常活化的信号通路,或抑制过表达的靶标,从而达到抗肿瘤的目的。靶向药物因其对癌细胞具有高度的选择性以及其低毒高效的特点逐渐成为肿瘤临床治疗的重要部分。人表皮生长因子2(Hunman epidermal growth factor receptor 2, HER2)与肿瘤的增殖、转移、侵袭相关。胃癌中同样存在HER2的表达[3],并且这种表达与预后相关。曲妥珠单抗(Trastuzumab, Herceptin)是一种靶向HER2的人源化的IgG单克隆抗体,可与细胞表面的EGFR特异性结合,竞争性阻断表皮生长因子(HER2)所介导的下游信号传递功能,并且可以促进抗体依赖性细胞毒性作用(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)。在HER2阳性晚期胃癌患者中联合使用曲妥珠单抗联合化疗的治疗方案较单用化疗有更好的有效性及安全性。2010年,美国FDA批准曲妥珠单抗联合化疗为进展期胃癌患者的一线治疗方案[7-9]。但是,HER2阳性胃癌患者对曲妥珠单抗的有效率不到60%；即使初始治疗有效,这种显著的效果往往是暂时性的,绝大部分患者在使用后1年内出现获得性耐药[10-12]。因此,我们尚需更加有效地检测指标能够预测曲妥珠单抗的敏感性[13,14],同时为更加精准的个体化治疗以及克服曲妥珠单抗的耐药提供新的靶点。肿瘤细胞即使在有氧条件下,也主要通过糖酵解方式分解葡萄糖以获取能量,而非通过三羧酸循环和氧化磷酸化途径生产ATP,肿瘤细胞的这种有氧糖酵解现象被称为Warburg效应[15,16]。糖代谢的紊乱与肿瘤恶性转化互为因果,相互促进。肿瘤细胞的这种特殊糖代谢方式与其对多种细胞毒性药物及靶向药物的耐药有关[18,19]。参予调控Warburg效应的多种蛋白因子在抗肿瘤药物的耐药机制中发挥重要作用,例如：葡萄糖转运体(glucose transporter, GLUT)、己糖激酶(hexokinase, HK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDHA)[24]等。在乳腺癌曲妥珠单抗耐药机制的研究中,已有研究发现通过调节糖酵解途径能促使HER2阳性乳癌细胞对曲妥珠单抗耐药[23,25]。由此可见,Warburg效应是抗肿瘤药物耐药的重要调控因素。因此,抑制Warburg效应可能成为遏制及逆转肿瘤耐药的有效手段之一。PI3K/AKT信号通路作为重要的肿瘤恶性生物学行为调控通路,在肿瘤细胞代谢[26-28]及抗肿瘤药物耐药机制中发挥举足轻重的作用。肿瘤靶向药物的耐药机制之一就是信号通路的活化。目前已知PI3K/AKT信号通路参与调控乳腺癌曲妥珠单抗耐药[29-31]。已有研究发现,在胃癌曲妥珠单抗治疗过程中,PI3K/AKT信号通路活性改变,我们前期研究也证实了PI3K/AKT信号通路参与调节人HER2阳性胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药[33]。因此我们有理由相信上游癌基因可以通过激活PI3K/AKT信号通路直接,或者通过调控Warburg效应间接影响曲妥珠单抗对胃癌细胞的敏感性。结肠癌转移相关基因-1(Metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1)的表达与结肠癌转移及预后密切相关,其在肝癌[35]、胰腺癌、肺癌、卵巢癌[38]等多种恶性肿瘤中高表达,并促进肿瘤的增殖、侵袭及迁移。MACC1可通过AKT/c-Met信号通路参与对肿瘤恶性生物学行为的调控[39,40]。我们的前期研究发现,MACC1在胃癌组织高表达,并且其表达水平与胃癌的分期、术后复发、转移及死亡相关,MACC1高表达的胃癌患者临床预后更差,并且,在氧化应激作用下,MACC1能通过增强Warburg效益促进胃癌细胞生长[42]。但目前尚无MACC1影响胃癌耐药的报道。鉴于肿瘤恶性生物学行为与代谢紊乱的相互关系,我们猜测能使胃癌恶性化的MACC1也参与到抗肿瘤药物的耐药调控中,其中机制可能涉及MACC1通过调控其下游PI3K/AKT信号通路影响肿瘤细胞的Warburg效应。因此,我们拟研究MACC1与胃癌细胞Warburg效应之间的关系及可能的调控机制,进而探讨MACC1参与调控胃癌曲妥珠单抗耐药的可能机制。二、研究目的本课题以人HER2阳性胃癌细胞株为研究对象,通过构建人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞系以及MACC1过表达及干扰稳定转染细胞系,通过体外及体内实验,对MACC1基因参与调控胃癌曲妥珠单抗的耐药机制进行深入探讨,希望能够筛选出曲妥珠单抗的耐药预测指标,从而更好地选择曲妥珠单抗治疗的目标人群,为下一步逆转靶向药物耐药的临床研究奠定实验基础。三、主要研究方法1.细胞株筛选：采用Western Blot及MTT法,从五株人胃癌细胞株中筛选出HER2和MACC1表达均阳性、对曲妥珠单抗作用最敏感(NCI-N87)及较敏感(MKN45)的胃癌细胞株为研究对象。2.耐药细胞系的建立及耐药特征分析：采用逐步增加剂量法诱导构建对曲妥珠单抗耐药的人胃癌细胞系。3.MTT法检测细胞增殖抑制率：取对数生长期细胞接种于96孔板,各药物浓度处理组均设5复孔,加入处理药物,培养72小时,MTT法检测OD值,计算细胞增殖抑制率。4. MACC1过表达及干扰稳定转染细胞株的建立：构建pLVX-MCMV-ZsGreen-PGK-Puro-MACC1表达质粒及pLVX-shMACC1干扰质粒。利用NCI-N87及MKN45亲代细胞株,通过质粒转染构建MACC1过表达、干扰及其对照空载体稳定转染细胞株。5.细胞葡萄糖摄取量检测：取对数生长期细胞接种于96孔板,每一处理组设3复孔,收集细胞培养液上清,利用Amplex(?)红葡萄糖/葡萄糖氧化测定试剂盒(Amplex(?) Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit),检测细胞培养上清葡萄糖含量。6.细胞乳酸含量检测：取对数生长期细胞接种于96孔板,每一处理组设3复孔,收集细胞培养液上清,利用乳酸检测试剂盒(Lactate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit),检测细胞培养上清乳酸含量。7.AKT信号通路抑制：利用AKT1/2/3抑制剂MK2206、PI3Kα/δ/β抑制剂LY294002适当剂量处理细胞,抑制细胞PI3K/AKT信号通路活性。8.AKT信号通路持续激活：利用AKT持续激活质粒Myr-AKT6转染细胞,持续激活AKT信号通路。9. CalcuSyn 2.0软件分析药物联合作用：按照CalcuSyn 2.0药物联合指数计算软件说明,根据细胞不同药物的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration IC50),设计药物作用浓度(尽量使抑制率平均涵盖1-100%区间)。通过CalcuSyn 2.0软件,计算协同指数(Combined Index CI)值,分析两药是否具有协同效应。10.细胞凋亡率检测：以AV/PI双染凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。11.裸鼠成瘤模型：以MACC1过表达、干扰及其对照组空载体转染细胞株,进行裸鼠皮下成瘤,构建BALB/c裸鼠成瘤模型,并分别予以PBS、曲妥珠单抗、糖代谢抑制剂以及曲妥珠单抗联合糖代谢抑制剂处理成瘤裸鼠；分别利用免疫组化、Western blot等方法,检测肿瘤组织MACC1蛋白表达水平；利用micro-PET-CT、检测肿瘤细胞糖代谢水平；定期测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。12. TUNEL检测细胞凋亡：裸鼠成瘤后及药物处理完毕,处死裸鼠,取肿瘤组织,进行TUNEL染色,检测肿瘤组织细胞凋亡水平。13.蛋白、基因表达水平检测：Western Blot法检测细胞及组织相关蛋白的表达水平；实时荧光定量PCR法(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR QRT-PCR)检测细胞相关基因的表达水平。14. SPSS 20.0软件统计分析处理实验数据：利用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计学分析,采用Student’s-T检验方法进行两组之间数据的比较；采用Oneway-ANOVA检验方法进行多组之间数据的比较；所有实验数据均采用x±s表示,P值<0.05被视为有统计学差异。四、研究内容1. MACC1与胃癌曲妥珠单抗耐药的相关性研究1.1细胞株筛选：Western Blot检测5种人胃癌细胞株BGC823、MKN45、 MKN28、NCI-N87、SGC7901中HER2及MACC1蛋白表达水平,MTT检测五株细胞对曲妥珠单抗的敏感性,从中筛选出HER2和MACC1表达均阳性、且对曲妥珠单抗最敏感(NCI-N87)及较敏感(MKN45)的细胞株作为研究对象。1.2耐药细胞株的建立以及耐药特征分析1.2.1耐药细胞株的建立：根据筛选结果,利用NCI-N87和MKN45细胞株,采用逐步增加剂量法,诱导构建曲妥珠单抗耐药细胞株NCI-N87/TR和MKN45/TR。曲妥珠单抗药物刺激最终浓度为3500μg/ml(NCI-N87)和2560μg/ml (MKN45),细胞在培养基中稳定生长,成功构建曲妥珠单抗耐药细胞,分别命名为NCI-N87/TR(前期实验已构建)和MKN45/TR。1.2.2耐药指数检测：MTT检测细胞490nm或者560nm处OD值,按公式计算细胞存活率：细胞存活率=(加药组OD值—空白对照组OD值)/(正常对照组OD值—空白对照组OD值)×100%；细胞增殖抑制率=100%—细胞存活率；利用CalcuSyn 2.0软件,绘制浓度-细胞增殖抑制率曲线,计算亲代细胞及耐药细胞IC50；计算耐药指数(RI)=IC50(亲代细胞)/IC50(耐药细胞)。1.3 MACC1对胃癌耐药细胞曲妥珠单抗敏感性影响：siRNA瞬时干扰NCI-N87/TR和MKN45/TR的MACC1基因表达,Western blot验证干扰效果；MTT检测曲妥珠单抗处理72小时后细胞增殖抑制率,比较干扰MACC1基因前后细胞对曲妥珠单抗敏感性变化。1.4 MACC1对胃癌亲代细胞曲妥珠单抗敏感性影响：构建pLVX-MCMV-ZsGreen-PGK-Puro-MACC1表达质粒及pLVX-shMACC1干扰质粒；利用Lipofectamine(?)2000稳定转染NCI-N87及MKN45; QRT-PCR及Western blot验证转染效果；MTT检测曲妥珠单抗处理72小时后细胞增殖抑制率,比较MACC1过表达及干扰前后细胞对曲妥珠单抗敏感性变化。2. MACC1与胃癌细胞Warburg效应相关性研究2.1 MACC1是否调控胃癌细胞Warburg效应：利用Amplex(?)红葡萄糖/葡萄糖氧化测定试剂盒以及乳酸检测试剂盒定量检测MACC1过表达、干扰及其对照细胞株培养上清葡萄糖含量及乳酸含量,计算细胞葡萄糖摄取量及乳酸产量。2.2MACC1是否调控胃癌细胞Warburg效应相关蛋白表达：Western blot检测MACC1过表达、干扰及其对照细胞株GLUT1、HK2及LDHA蛋白表达水平,并比较其差异,分析MACC1对细胞糖代谢水平的影响。2.3 MACC1是否调控耐药细胞Warburg效应：Western blot检测NCI-N87/TR、 MKN45/TR及其MACC1基因被干扰后细胞的GLUT1、HK2及LDHA蛋白表达水平,比较干扰前后表达差异,在耐药细胞中一步明确MACC1对Warburg效应的调控作用。3.曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂协同作用相关研究3.1曲妥珠单抗是否抑制胃癌细胞Warburg效应：利用Amplex(?)红葡萄糖/葡萄糖氧化测定试剂盒以及乳酸检测试剂盒,检测曲妥珠单抗处理后细胞培养上清的葡萄糖含量及乳酸含量,计算细胞葡萄糖摄取量及乳酸产量,明确曲妥珠单抗对胃癌细胞Warburg效应的抑制作用。3.2 Warburg效应是否参与耐药形成：Western blot检测NCI-N87、MKN45及NCI-N87/TR、MKN45/TR中GLUT1、HK2及LDHA蛋白表达水平,比较表达差异,明确胃癌细胞在对曲妥珠单抗产生耐药后Warburg效应的变化,明确Warburg效应是否参与曲妥珠单抗的耐药形成。3.3曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂是否具有协同抑制细胞增殖作用：NCI-N87、MKN45及NCI-N87/TR、MKN45/TR经曲妥珠单抗、乳酸脱氢酶抑制剂(草氨酸钠,oxamate,OX)、己糖激酶抑制剂(2-脱氧-D-葡萄糖,2-Deoxy-D-glucose,2-DG)单药或者曲妥珠单抗联合OX/2-DG处理,MTT检测细胞增殖抑制率；CalcuSyn 2.0软件绘制效应曲线,计算CI值,分析曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂是否具有协同抑制细胞增殖活性的作用。3.4曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂是否具有协同抑制细胞糖代谢作用：NCI-N87、MKN45及NCI-N87/TR、MKN45/TR经曲妥珠单抗、OX/2-DG单药或者曲妥珠单抗联合OX/2-DG处理,利用Amplex(?)红葡萄糖/葡萄糖氧化测定试剂盒以及乳酸检测试剂盒,检测细胞培养上清的葡萄糖含量及乳酸含量；CalcuSyn 2.0软件绘制效应曲线,计算CI值,分析曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂是否具有协同抑制细胞糖代谢的作用。4. MACC1通过PI3K/AKT信号通路调控Warburg效应影响胃癌曲妥珠单抗耐药相关机制研究4.1曲妥珠单抗是否抑制胃癌细胞PI3K/AKT信号通路活化：Western blot检测曲妥珠单抗处理后,NCI-N87及MKN45细胞AKT、p-AKT蛋白表达水平,明确曲妥珠单抗对胃癌细胞PI3K/AKT信号通路是否具有抑制作用。4.2 MACC1是否促进胃癌细胞PI3K/AKT信号通路活化：Western blot检测MACC1过表达、干扰及其对照细胞中AKT、p-AKT蛋白表达水平,明确MACC1是否能调控胃癌细胞PI3K/AKT信号通路的活化。4.3 MACC1是否通过PI3K/AKT信号通路调控胃癌细胞Warburg效应及曲妥珠单抗敏感性4.3.1 NCI-N87和MKN45过表达MACC1后,通过AKT抑制剂MK2206抑制AKT活化,利用Amplex(?)红葡萄糖／葡萄糖氧化测定试剂盒以及乳酸检测试剂盒,检测细胞培养上清葡萄糖含量及乳酸含量,MTT检测曲妥珠单抗作用后细胞增殖抑制率,比较不同处理组细胞糖代谢水平及对曲妥珠单抗敏感性的变化。4.3.2 NCI-N87和MKN45共转染MACC1干扰质粒siRNA和AKT激活质粒Myr-AKT,利用Amplex(?)红葡萄糖／葡萄糖氧化测定试剂盒以及乳酸检测试剂盒,检测细胞培养上清葡萄糖含量及乳酸含量,MTT检测曲妥珠单抗作用后细胞增殖抑制率,比较不同处理组细胞糖代谢水平及对曲妥珠单抗敏感性的变化。4.3.3 NCI-N87和MKN45过表达MACC1后,通过PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活化,AV/PI双染凋亡试剂盒检测曲妥珠单抗处理后细胞凋亡率,比较不同处理组曲妥珠单抗促细胞凋亡的差异。通过4.3.1,4.3.2,4.3.3的实验,明确PI3K/AKT信号通路在MACC1调控胃癌细胞Warburg效应及其对曲妥珠单抗敏感性中的作用。5. MACC1调控Warburg效应以及胃癌曲妥珠单抗耐药的体内实验研究5.1构建BALB/c裸鼠成瘤模型：以MACC1稳定过表达、干扰及其对照细胞,进行裸鼠皮下成瘤,构建BALB/c裸鼠成瘤模型,分别予以PBS、曲妥珠单抗处理成瘤裸鼠。5.2肿瘤体积测量：肿瘤细胞皮下注射后一周开始测量肿瘤体积,2次／周,分别测量肿瘤的最长径(L)与最短径(W),肿瘤体积=(L×W2) /2 (mm3),绘制肿瘤生长曲线,比较不同处理组之间肿瘤体积的差异,体内水平证实MACC1是否对胃癌曲妥珠单抗耐药具有促进作用。5.3肿瘤细胞糖代谢水平检测：利用micro-PET-CT成像技术,检测成瘤后及药物处理完成后,成瘤裸鼠肿瘤细胞对18F-FDG的摄取水平,比较不同处理组之间肿瘤细胞糖代谢的差异,体内水平证实MACC1是否对胃癌肿瘤细胞Warburg效应具有增强作用。5.4肿瘤组织细胞凋亡水平检测：给药完成后处死裸鼠,取肿瘤组织,进行TUNEL染色,检测肿瘤细胞凋亡水平,比较不同处理组之间肿瘤细胞凋亡水平的差异,体内水平证实MACC1是否影响曲妥珠单抗对胃癌细胞的促凋亡作用。6.曲妥珠单抗联合糖代谢抑制剂协同作用体内相关实验研究6.1构建BALB/c裸鼠成瘤模型：以MACC1稳定过表达、干扰及其对照细胞株,进行裸鼠皮下成瘤,构建BALB/c裸鼠成瘤模型,分别予以PBS、曲妥珠单抗、OX以及曲妥珠单抗联合OX处理成瘤裸鼠。6.2肿瘤体积测量：方法同5.2,体内水平证实曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂是否具有协同抑制肿瘤生长的作用。6.3肿瘤细胞糖代谢水平检测：方法同5.3,体内水平证实曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂是否具有协同抑制肿瘤细胞糖代谢的作用。6.4肿瘤组织细胞凋亡水平检测：方法同5.4,体内水平证实曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂是否具有协同促进肿瘤细胞凋亡的作用。五、研究结果1. MACC1参与调控胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药1.1五株人胃癌细胞株HER2蛋白表达水平从高到低依次为：NCI-N87、 MKN45、SGC7901、MKN28、BGC823;五株细胞株MACC1蛋白表达均阳性；根据细胞曲妥珠单抗作用IC50,选取对曲妥珠单抗最敏感的NCI-N87 (IC50: 24.41 μg/ml)及较为敏感的MKN45 (IC50:30.30μg/ml)为本实验的研究对象。1.2成功构建曲妥珠单抗耐药细胞株MKN45/TR:曲妥珠单抗IC50为296.26μg/ml,耐药指数RI为9.78。1.3与亲本细胞株比较,NCI-N87/TR和MKN45/TR中MACC1蛋白表达水平明显上升；过表达NCI-N87和MKN45 MACC1基因,曲妥珠单抗对细胞增殖抑制率显著下降(P均<0.05)；干扰NCI-N87和MKN45 MACC1基因,曲妥珠单抗对细胞增殖抑制率显著上升(P均<0.05)；干扰耐药细胞MACC1基因,其对曲妥珠单抗的敏感性恢复(P均<0.05)。2. MACC1增强胃癌细胞Warburg效应2.1过表达NCI-N87和MKN45 MACC1基因,细胞糖代谢水平,包括葡萄糖摄取量和乳酸产量均显著上升(P均<0.05)；GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平均明显升高；干扰NCI-N87和MKN45 MACC1基因,细胞葡萄糖摄取量和乳酸产量均显著下降(P均<0.05),GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平均明显降低。2.2干扰NCI-N87/TR和MKN45/TR MACC1基因,细胞葡萄糖摄取量和乳酸产量均显著下降(P均<0.05),GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平均明显降低。3.曲妥珠单抗联合糖代谢抑制剂协同抑制胃癌细胞增殖及糖代谢3.1曲妥珠单抗抑制胃癌细胞Warburg效应：曲妥珠单抗作用NCI-N87和MKN45,细胞GLUT1、HK2、LDHA蛋白水平均明显降低,细胞葡萄糖摄取量和乳酸产量均随曲妥珠单抗作用浓度升高而降低(P均<0.05)。3.2曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂协同抑制细胞增殖：曲妥珠单抗联合OX/2-DG较曲妥珠单抗、OX、2-DG单药对NCI-N87、MKN45、NCI-N87/TR及MKN45/TR细胞增殖活性抑制作用更显著,通过CalcuSyn 2.0软件计算CI值均<1；与亲代细胞比较,联合用药对耐药细胞的协同抑制作用更加显著。3.3曲妥珠单抗与糖代谢抑制剂协同抑制细胞糖代谢：曲妥珠单抗联合OX/2-DG较曲妥珠单抗、OX、2-DG对NCI-N87、MKN45、NCI-N87/TR及MKN45/TR细胞葡萄糖摄取率抑制作用更显著,通过CalcuSyn 2.0软件计算CI值均<1.1；与亲代细胞比较,联合用药对耐药细胞的协同抑制作用更加显著。4. MACC1通过PI3K/AKT信号通路增强Warburg效应促进胃癌曲妥珠单抗耐药4.1曲妥珠单抗抑制胃癌细胞PI3K/AKT信号通路活化：曲妥珠单抗作用NCI-N87和MKN45,细胞p-AKT蛋白表达水平明显降低。4.2 MACC1促进胃癌细胞PI3K/AKT信号通路的活化：过表达NCI-N87和MKN45 MACC1基因,细胞p-AKT蛋白水平明显升高；干扰MACC1,细胞p-AKT蛋白水平明显降低。4.3过表达NCI-N87和MKN45 MACC1基因,利用AKT抑制剂MK2206抑制PI3K/AKT信号通路活化,细胞p-AKT、GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平明显下降；细胞葡萄糖摄取量和乳酸产量均显著下降(P均<0.05),细胞对曲妥珠单抗敏感性较对照组(不加MK2206处理组)显著升高(P<0.05)。4.4利用AKT激活质粒Myr-AKT与MACC1 siRNA共转染NCI-N87和MKN45细胞,细胞p-AKT、GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平均明显升高；细胞葡萄糖摄取量和乳酸产量均显著上升(P均<0.05),细胞对曲妥珠单抗敏感性较对照组(不加Myr-AKT、siRNA单独转染)显著降低(P<0.05)。5.体内水平证实MACC1增强Warburg效应并促进胃癌曲妥珠单抗耐药5.1利用NCI-N87 MACC1过表达、干扰及其对照细胞,构建裸鼠皮下成瘤模型,免疫组化验证肿瘤组织MACC1蛋白表达；micro-PET-CT裸鼠成像,结果显示：MACC1过表达肿瘤细胞18F-FDG摄取量高于对照,MACC1干扰肿瘤细胞18F-FDG摄取量低于对照。5.2荷瘤裸鼠分为PBS和曲妥珠单抗处理组：结果显示：曲妥珠单抗处理组内,MACC1过表达组肿瘤体积显著大于对照组(实验第23、26、29、33、36天,P均<0.05)；MACC1干扰组肿瘤体积显著小于对照组(给药后第19、26、29、33、36天,P均<0.05)。5.3给药完成后,荷瘤裸鼠行micro-PET-CT显像；处死裸鼠,取肿瘤组织,行TUNEL染色,结果显示：MACC1过表达组内,曲妥珠单抗处理组与PBS组比较,肿瘤体积、细胞凋亡水平差异均不显著；MACC1干扰组内,曲妥珠单抗处理组肿瘤体积显著低于PBS组(P<0.05),细胞凋亡水平显著高于PBS组(P<0.05)；micro-PET-CT显像提示,MACC1过表达组内,曲妥珠单抗处理组与PBS组肿瘤细胞I8F-FDG摄取量无明显差异；MACC1干扰组内,曲妥珠单抗处理组肿瘤细胞18F-TDG摄取量显著低于PBS组。6.曲妥珠单抗联合糖代谢抑制剂协同抑制胃癌肿瘤生长及糖代谢6.1利用NCI-N87 MACC1过表达、干扰及其对照细胞,构建裸鼠皮下成瘤模型；荷瘤裸鼠分组：PBS、曲妥珠单抗、OX、曲妥珠单抗联合OX；结果显示：MACC1过表达组内,联合给药组肿瘤体积显著小于曲妥珠单抗或OX单药组(实验第23、26、29、33、36天,P均<0.05)；对照组及MACC1干扰组内,联合给药组肿瘤体积与曲妥珠单抗或OX单药组无显著性差异。6.2给药结束后,荷瘤裸鼠行micro-PET-CT成像；处死裸鼠,取肿瘤组织,行TUNEL染色；结果显示：MACC1过表达组内,联合给药组与曲妥珠单抗或OX单药组比较,细胞凋亡水平显著升高(P<0.05)；对照组及MACC1干扰组内,联合给药组与曲妥珠单抗或OX单药组比较,细胞凋亡水平无显著性差异(P>0.05)；micro-PET-CT显像提示,MACC1过表达组内,联合给药组肿瘤细胞18F--FDG摄取量低于单药组：对照组及MACC1干扰组内,联合给药组与单药组比较,肿瘤细胞18F--FDG摄取量无明显差异。六、研究结论1. MACC1参与调控胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药：①HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药细胞MACC1蛋白表达水平上升,干扰耐药细胞MACC1表达,其耐药性逆转；②过表达MACC1,细胞对曲妥珠单抗敏感性降低；干扰MACC1,细胞对曲妥珠单抗敏感性升高。2. MACC1增强胃癌细胞Warburg效应：①过表达MACC1,细胞葡萄糖摄取量及乳酸产量显著升高；干扰MACC1,细胞葡萄糖摄取量及乳酸产量显著下降；②过表达MACC1,细胞GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平明显升高；干扰MACC1,细胞GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平明显下降；③干扰耐药细胞MACC1表达,GLUT1、HK2、LDHA蛋白表达水平明显下降。3.曲妥珠单抗联合糖代谢抑制剂对胃癌细胞增殖及糖代谢的协同抑制作用：①曲妥珠单抗联合OX/2-DG,可协同抑制细胞增殖及糖代谢；②曲妥珠单抗联合OX/2-DG,可协同抑制耐药细胞增殖及糖代谢；③曲妥珠单抗联合OX/2-DG,对耐药细胞增殖及糖代谢的协同抑制效应强于亲代细胞。4. MACC1通过PI3K/AKT信号通路增强Warburg效应促进曲妥珠单抗耐药：①曲妥珠单抗抑制人HER2阳性胃癌细胞PI3K/AKT信号通路活化；②MACC1促进人HER2阳性胃癌细胞PI3K/AKT信号通路活化；③过表达MACC1,同时抑制PI3K/AKT信号通路活化,细胞糖代谢水平下降,曲妥珠单抗促细胞凋亡作用增强,对曲妥珠单抗耐药性逆转；④干扰MACC1,同时激活PI3K/AKT信号通路,细胞糖代谢水平升高,曲妥珠单抗促细胞凋亡作用减弱,对曲妥珠单抗敏感性降低。5.体内实验证明,MACC1增强Warburg效应并促进曲妥珠单抗耐药：①曲妥珠单抗处理组内,MACC1过表达组肿瘤体积显著大于对照组；MACC1干扰组肿瘤体积显著小于对照组；②MACC1过表达组内,曲妥珠单抗组与PBS组比较,肿瘤体积、凋亡水平无统计学差异；③干扰MACC1组内,曲妥珠单抗组与PBS组比较,肿瘤体积显著减小,细胞凋亡水平显著升高；(Dmicro-PET-CT显像提示,MACC1蛋白表达升高可减弱曲妥珠单抗抑制肿瘤细胞Warburg效应的作用。6.体内实验证明,糖代谢抑制剂促进曲妥珠单抗抑制肿瘤细胞生长及糖代谢的作用：①MACC1过表达组内,联合用药组与曲妥珠单抗或OX单药组比较,肿瘤体积显著减小、细胞凋亡水平上升；②干扰MACC1组内,联合用药组与曲妥珠单抗或OX单药处组比较,肿瘤体积、细胞凋亡水平无统计学差异；③micro-PET-CT显像提示,在MACC1过表达情况下,联合使用糖代谢抑制剂能促进曲妥珠单抗抑制肿瘤细胞糖代谢的作用。七、全文总结MACC1通过激活PI3K/AKT信号通路增强Warburg效应,促进人HER2阳性胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药；MACC1有可能作为临床HER2阳性胃癌患者对曲妥珠单抗耐药的预测指标；曲妥珠单抗获得性耐药患者中,MACC1有可能作为联合使用糖代谢抑制剂的筛选指标指导进一步用药,从而逆转胃癌曲妥珠单抗耐药。