【摘 要】
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细胞壁连接的类受体激酶(Wall-associated kinases,WAK)是一类典型的可与细胞壁直接结合的RLK(Receptor like Kinase)亚家族,在维持细胞壁完整性、细胞间通讯、重金属离子胁迫、生物和非生物应激反应中发挥重要作用。WAK亚家族的鉴定以及响应病原菌侵染的功能分析已经在多种植物中被报道,但在马铃薯中尚未见深入报道。基于此,本论文以马铃薯品种‘大西洋’为试验材料,
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细胞壁连接的类受体激酶(Wall-associated kinases,WAK)是一类典型的可与细胞壁直接结合的RLK(Receptor like Kinase)亚家族,在维持细胞壁完整性、细胞间通讯、重金属离子胁迫、生物和非生物应激反应中发挥重要作用。WAK亚家族的鉴定以及响应病原菌侵染的功能分析已经在多种植物中被报道,但在马铃薯中尚未见深入报道。基于此,本论文以马铃薯品种‘大西洋’为试验材料,采用生物信息学、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)、农杆菌介导等方法对马铃薯WAK亚家族进行鉴定并对其响应晚疫病菌(Phytophthora infestans,Pi)侵染的表达模式和功能进行分析,取得以下主要结论:1.与对照组相比,晚疫病菌侵染马铃薯叶片后,叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度显著下降,而渗透调节物质(Pro、MDA和木质素)的含量和抗氧化酶(POD、SOD和PAL)的活性均增加,说明晚疫病菌侵染严重影响了马铃薯的生理特性。2.利用生物信息学方法对马铃薯WAK亚家族进行系统分析,结果显示,从马铃薯基因组中共鉴定出29个WAKs基因,其中,21个基因参与串联重复。首先,理化性质分析发现,St WAKs基因的等点电、分子量、不稳定性指数、氨基酸数等方面都存在较大差异。其次,进化分析发现,来自马铃薯、拟南芥、番茄和苹果四个物种的WAK家族成员可分为6个亚组,其中,St WAK亚家族成员分布在GroupⅡ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。再次,顺式作用元件分析表明,St WAKs基因启动子区域富含响应植物激素、植物生长发育、防御和生物胁迫信号等相关的顺式响应元件,说明该亚家族成员在响应逆境胁迫方面存在潜在功能。最后,基于q RT-PCR分析,St WAKs基因在晚疫病菌侵染条件下差异表达,其中St WAKL3和St WAKL4基因的表达量随侵染时间的延长而逐渐增强。3.对前期筛选得到的抗病基因St WAKL3和St WAKL4进行克隆和过表达载体构建,分析这2个基因响应马铃薯晚疫病菌侵染信号的功能。结果表明:注射St WAKL3-p FGC5941和St WAKL4-p FGC5941农杆菌的马铃薯叶片受到晚疫病菌侵染时,病斑面积明显小于对照组。注射St WAKL3-p FGC5941农杆菌时,马铃薯叶片中与SA、JA、病原菌与植株互作信号途径相关基因的表达量显著上调;注射St WAKL4-p FGC5941农杆菌时,马铃薯叶片中与SA、ET、病原菌与植株互作信号途径相关基因的表达量显著上调。4.通过农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系,将St WAKL3和St WAKL4成功导入马铃薯‘大西洋’中,分别获得马铃薯过表达株系5株。晚疫病菌侵染叶片后,发现转基因马铃薯株系叶片中的Pro含量、POD和SOD活性明显高于野生型马铃薯、MDA和H2O2含量明显低于野生型马铃薯、DAB染色的颜色比野生型马铃薯浅、St WAKL3和St WAKL4的表达量显著高于野生型马铃薯。说明St WAKL3和St WAKL4基因在马铃薯晚疫病抗性中具有正调控作用。
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