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实验目的:骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一种具有成骨成脂分化能力的多能干细胞,这种分化能力受到多种因素的调控,前期研究发现,高脂血症可导致大鼠种植体周围骨形成减少,骨结合不良。液泡分选蛋白26（vacuolar sorting proteins26,VPS26）具有促进拟南芥生长以及负责生物囊泡内物质运输等功能,但VPS26在细胞增殖分化过程中的功能仍然未知,有研究表明VPS26可转运Wnt蛋白,而Wnt蛋白在促进BMSCs分化的过程中至关重要。本研究的实验目的:①探究在VPS26的调控下,通过Wnt/β-catenin通路影响BMSCs成脂成骨分化;②探究VPS26对异位成骨以及高脂血症大鼠种植体周围骨结合的影响。实验方法:（1）研究VPS26影响BMSCs分化:①高脂/普通环境下对BMSCs进行成骨诱导,RT-PCR检测VPS26的表达;②在BMSCs中过表达VPS26,Western blot检测成骨分化指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、Runt相关的转录因子2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）,成脂分化指标过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPAR-γ）、脂肪酸结合蛋白4（fatty acid-binding protein 4,FABP4）以及Wnt通路相关因子的表达变化;ALP、油红O染色观察VPS26影响BMSCs成骨、成脂分化的作用;③在BMSCs过表达VPS26后再沉默VPS26,通过挽救实验来测定成骨、成脂分化指标和Wnt通路中相关因子的表达变化。（2）研究VPS26影响BMSCs分化的具体机制:①提取BMSCs蛋白样品,通过免疫共沉淀检测VPS26与β-catenin的结合;②免疫荧光共定位检测VPS26与β-catenin的位置;③在BMSCs低/过表达VPS26后,转染top/fop质粒,加入Wnt通路激动剂Wnt3a,通过双荧光素酶基因报告、Western blot测定Wnt相关因子表达。（3）研究VPS26影响异位成骨以及高脂血症大鼠种植体骨结合:①高脂与普通喂养大鼠8w后取其股骨,通过免疫组化检测VPS26在成骨细胞中的表达;②在BMSCs中过/低表达VPS26,加入羟基磷灰石/磷酸三钙复合材料（HA/TCP）支架搭载,成骨诱导7天后,植入裸鼠背部皮下,硬组织切片HE染色来检测VPS26对于骨形成的影响,并通过免疫组化观察β-catenin的表达;③成功构建高脂血症模型,在高脂血症大鼠中过表达VPS26后,RT-PCR检测成骨、成脂分化指标表达,通过Micro-CT、硬组织切片染色检测种植体周围骨形成和脂肪形成状况。实验结果:（1）高脂环境抑制VPS26表达:高脂成骨诱导BMSCs后,BMSCs中VPS26的表达随诱导天数增加不断降低,但在普通成骨诱导组中,VPS26的表达随诱导天数增加而升高。（2）过表达VPS26可以促进BMSCs成骨分化,抑制成脂分化:VPS26过表达组较阴性对照组:VPS26、β-catenin、CCND1表达升高,成骨相关指标ALP、RUNX2表达升高,成脂分化指标FABP4、PPAR-γ表达降低,且矿化结节形成数量增多,脂滴形成数量减少,BMSCs成骨分化能力增强,成脂分化能力减弱。（3）对过表达VPS26的BMSCs再次抑制VPS26的表达,可逆转其对成骨成脂分化的影响:在BMSCs中过表达VPS26后,再次抑制VPS26的表达,可观察到上调的β-catenin、CCND1的表达被抑制,成骨相关指标RUNX2表达被抑制,下调的成脂分化指标FABP4、PPAR-γ表达再次升高。（4）VPS26通过与β-catenin结合发挥作用:①免疫共沉淀示VPS26与β-catenin相互作用;②免疫荧光共定位示VPS26与β-catenin在BMSCs中共定位;③TOPFLASH示:在加入Wnt3a后,与阴性对照组相比,VPS26过表达组TOP/FOP值升高;与阴性对照组相比,VPS26抑制表达组TOP/FOP值降低;④在BMSCs中低表达VPS26后,加入激动剂Wnt3a,与阴性对照组相比,VPS26抑制表达组β-catenin的表达量变化不大,VPS26的低表达一定程度上抑制了 Wnt通路的活性。（5）过表达VPS26促进裸鼠皮下异位骨生成,低表达VPS26抑制异位骨生成:①与阴性对照组相比,VPS26过表达组异位新骨形成明显增多;②与阴性对照组相比,VPS26抑制表达组异位新骨形成明显减少。（6）过表达VPS26可以减弱高脂血症造成的大鼠种植体周围骨结合不良的情况:大鼠股骨硬组织切片免疫组化结果显示,高脂大鼠股骨成骨细胞中VPS26表达明显低于普通大鼠;与阴性对照组相比,VPS26过表达组种植体周围新骨形成增多,骨量升高,脂肪形成减少;且成骨分化指标ALP表达增高,成脂分化指标PPAR-γ、FABP4表达降低。结论:1.过表达VPS26促进BMSCs成骨分化,抑制成脂分化。2.VPS26促进异位成骨以及高脂血症大鼠种植体周围骨结合。3.VPS26通过Wnt/β-catenin通路发挥调控BMSCs成骨、成脂分化的作用。