H17N10亚型蝙蝠流感病毒NS1单克隆抗体制备

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenzhong1983
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甲型流感病毒属于正黏病毒科,基因组由8个节段的单股负链RNA组成,通过剪切拼接、移码等机制,至少编码14种病毒蛋白。流感病毒亚型分类根据两种主要的表面蛋白,血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。在鉴定出蝙蝠流感病毒(Bat Influenzavirus,BIV)之前,已有16种HA亚型和9种NA亚型被发现,主要存在于鸟类、水禽体内。在这些病毒中,只有H1N1、H2N2和H3N2能感染人并引起大流行。最近,有两个新亚型在危地马拉小黄肩蝙蝠(叶口蝠科黄肩蝠属)和秘鲁平脸果蝠(叶口蝠科牙买加果蝠属)中被发现可能存在H17N10和H18N11两种新型的流感病毒。  非结构蛋白(NS1)是流感病毒中最主要的多功能免疫抑制因子,与双链RNA(dsRNA)结合,导致病毒在复制时dsRNA的减少,从而抑制抗病毒信号传导通路,阻止干扰素-α/β(IFN-α/1β)产生;抑制应激激活蛋白激酶(Jun N-terminal Kinase,JNK)和转录激活因子(Transcription Activitor, AP-1)的激活,导致抗病毒和炎性细胞因子的基因不能正常转录;NS1与视黄酸诱导基因-I(RIG-I)形成复合体,阻止前转录中干扰素的合成。在抗干扰素和其他多种抑制先天性免疫途径中发挥了上调作用。H17N10亚型蝙蝠流感病毒与其他A型流感病毒的NS1具有50%同源性,但BNS1却极可能显示出更强的免疫调节作用。重组H17N10亚型蝙蝠流感病毒NS1(以下缩写为:BNS1)的PR8抗干扰素活性显著被增强。BNS1可结合双链RNA,显著抑制天然免疫反应。  本研究通过构建H17N10亚型蝙蝠流感病毒NS1基因的原核表达载体,利用原核表达产物制备小鼠多抗血清,经间接免疫荧光实验(IFA)检测其特异性。用真核表达载体p3 Tag-BNS1转染293T细胞进行免疫印迹检测。通过IFA及Western-blot检测,结果:BNS1原核表达产物为可溶性表达;BNS1多抗抗血清能与BNS1真核表达产物发生特异性结合;BNS1抗血清具备良好的免疫学活性。  利用H17N10亚型流感病毒的NS1蛋白原核表达产物免疫Balb/C小鼠,制备单克隆抗体。用真核表达载体p3Tag-BNS1转染的293T细胞作为筛选抗原,间接免疫荧光法筛选单抗,结果获得了5株特异性单抗,分别命名为:5E5、2B1、2D9、4G12、6A11。经间接免疫荧光及免疫印迹检测,结果发现:这五株单抗均有较好的免疫荧光效价;只有5E5和2B1两株单抗的免疫印迹呈阳性反应,其余3株全为阴性结果。分别将H1N1、H5N1、H9N2、H10N8、H10N3、H10N7、H17N10、H18N11亚型流感病毒NS1的真核表达质粒分别转染293T细胞,通过IFA鉴定发现:仅5E5单抗对蝙蝠流感病毒具有特异性。单克隆抗体亚类鉴定显示:2B1株为IgM,其余4株都为IgG2a。为鉴定BNS1单抗识别的抗原表位,构建BNS1截短体质粒,经原核表达,免疫印迹检测,结果显示:2B1单抗针对的抗原表位是30DAPF33,5E5单抗针对的抗原表位是34E。双分子荧光素酶报告系统检测发现:BNS1能够明显抑制IFN-β启动子活性。NS1单抗的制备对研究该蛋白功能及结构有重要意义,这为下一步深入研究BNS1的生物学功能奠定了基础。
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