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研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以进行性认知障碍为主要表现的神经退行性疾病。AD的特征性病理改变是在特定脑区形成老年斑、神经原纤维缠结及神经元和突触缺失。β淀粉样蛋白(Beta-Amyloid protein,Aβ)是老年斑的主要成分,由淀粉样前体蛋白(amyloid-βprecursorp rotein,APP)裂解产生。近年来研究表明,APP的代谢异常及Aβ生成增加是AD发病的中心环节。虽然国内外学者在APP异常代谢和Aβ生成的调控机制研究方面取得了突破性的进展,但具体机制还不明确。因此,深入研究APP的代谢调控路径仍然是一项迫切需要解决的课题,对推动AD的发病机制及防治研究进展具有重要意义,这也是本课题的立项出发点。糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products, AGEs)是蛋白质非酶糖化的终末不可逆聚合物,正常情况下体内AGEs的水平随增龄而缓慢增加,而脑组织是代谢最活跃的器官之一,其能量代谢完全依赖有氧氧化,脑组织中活性糖增加易于发生糖化修饰促使AGEs增加。Castellani[1]等研究证实早期AD患者脑内神经元有AGEs存在,随病程进展AGEs的增多与脑内Ap沉积和老年斑数量呈正相关,提示AGEs增加贯穿AD的整个发病过程；Munch[2]等用AGEs抑制剂替尼司坦(Tenilsetam)治疗AD患者,结果显示该药可使AD患者的认知功能改善,上述研究支持AGEs是参与AD发生和发展的重要因素。结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor, CTGF)是一种由多种细胞表达和分泌的相对分子质量为36000～38000的有丝分裂原多肽,正常生理情况下体内的CTGF表达很低或无表达,在病理情况下,CTGF过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生密切相关,如视网膜病变、动脉粥样硬化、肾纤维化、肺纤维化、肝硬化和慢性胰腺纤维化[3-9]等。2003年Ueberham[10]等应用免疫组化技术首次发现AD患者脑内如内嗅区、海马和颞叶CTGF表达明显增加,邻近老年斑的神经元和星形胶质细胞内CTGF表达也明显增加并与神经原纤维缠结病变呈正相关,而正常老年人脑内神经元表达低水平的CTGF,神经胶质细胞不表达CTGF,提示CTGF与AD老年斑形成和神经原纤维缠结等病理改变有关。国内外多项研究[11,12,13]表明,AGEs作用其受体RAGE能明显上调多种培养细胞和组织器官中CTGF表达,参与血管、肾脏、视网膜等靶器官损害。Zhao[14]等根据显示CTGF可通过MAPK/PI-3/AKT途径调控APP代谢并促进Aβ生成,是参与AD发病过程的重要细胞因子；然而,在AD患者脑中CTGF表达增强的原因尚不清楚,而CTGF对APP代谢影响在AD发病过程中的地位也并不十分明了。AGEs及其受体RAGE对脑组织内CTGF表达的影响及APP异常代谢的作用尚未见报道。因此,探讨AGEs通过作用其受体诱导CTGF表达及其与APP代谢、Ap生成的相关性和可能的信号通路,为揭示AD发病机制及选择治疗靶点提供依据,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。目的(1)探讨糖基化终末产物(AGEs)对大鼠海马神经元内结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。(2)探讨CTGF与海马神经元内淀粉样前体蛋白(APP)代谢的相关性及其可能的作用机制。(3)明确AGEs-RAGE-CTGF通路在AD病理变化中的作用。方法70只Wistar大鼠随机分为7组(各组n=10),各组用微量注射泵海马内注射法制造动物损伤模型：正常对照组(NC组,注射生理盐水,每侧4μl)、牛血清白蛋白对照组(BSA-C组,注射牛血清蛋白,每侧4μl)、糖基化修饰的牛血清白蛋白组(AGE-BSA组,注射AGE-BSA,每侧4μl)、RAGE中和抗体组(RAGE-Ab组,先注射单克隆中和抗体RAGE-Ab,每侧2μl,15分钟后再注射AGE-BSA,每侧4μL)、RAGE中和抗体对照组(RAGE-Ab-C组,注射RAGE中和抗体,每侧4μl)、CTGF中和抗体组(CTGF-Ab组,先注射单克隆中和抗体CTGF-Ab,每侧2μl,15分钟后再注射AGE-BSA,每侧4μL)、CTGF中和抗体对照组(CTGF-Ab-C组,注射CTGF中和抗体,每侧4μl)。3周后：通过HE染色检测海马区神经元病理改变；通过Morris水迷宫实验检测各组大鼠逃逸潜伏期(EL)；通过免疫组织化学检测各组大鼠海马TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1、IDE、APP和Aβ42蛋白表达；通过Western blot检测大鼠海马RAGE、TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1和IDE蛋白表达。结果1.Morris水迷宫实验AGE-BSA组逃避潜伏期较NC组、BSA-C组、RAGE-Ab-C组和CTGF-Ab-C组明显延长(P<0.01)；RAGE-Ab组和CTGF-Ab组逃避潜伏期较NC组延长(P<0.05); RAGE-Ab组和CTGF-Ab组逃避潜伏期较AGE-BSA组缩短(P<0.05)；NC组、BSA-C组、RAGE-Ab-C组和CTGF-Ab-C组之间逃避潜伏期无明显差别。2.免疫组织化学检测各组大鼠海马TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1、IDE、APP和Aβ42蛋白表达NC组、BSA-C、RAGE-Ab-C组和CTGF-Ab-C组之间TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1、IDE、APP和AP42蛋白着色无明显差异；在AGE-BSA组大鼠的大脑海马区神经元内：TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1、APP和Aβ42着色呈棕黄色,颜色灰度明显高于NC组；而RAGE-Ab组和CTGF-Ab组大鼠海马神经元内上述指标颜色灰度较AGE-BSA组明显减弱；AGE-BSA组海马神经元内IDE表达减少,颜色灰度低于NC组,RAGE-Ab组和CTGF-Ab组较AGE-BSA组表达增多,着色较深。3. Western blot检测各组大鼠海马RAGE、TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1和IDE蛋白表达并进行半定量分析(1) AGE-BSA组RAGE、TGF-β1蛋白表达明显高于NC组(P<0.01),分别是NC组的1.4倍和2倍；与AGE-BSA组比较,RAGE-Ab组RAGE、TGF-β1蛋白表达明显减少,下降率分别为7%和9%(P<0.05)；NC组、BSA-C组、RAGE-Ab-C组之间RAGE、TGF-β1蛋白表达无显著性差异。提示AGE能上调海马组织RAGE、TGF-β1蛋白表达。(2) AGE-BSA组CTGF蛋白表达相对指数为0.76,是NC组CTGF蛋白表达系数的1.9倍(P<0.01)；与AGE-BSA组比较,RAGE-Ab组CTGF蛋白表达明显减少(P<0.05)；NC组、BSA-C组、RAGE-Ab-C组之间CTGF蛋白表达无显著性差异。提示AGE通过作用RAGE上调海马组织CTGF的蛋白表达。(3) AGE-BSA组BACE1、PS-1蛋白表达系数分别为(0.76、0.74)；是NC组BACE1、PS-1蛋白表达系数(0.50、0.44)的1.5倍和1.7倍(P<0.01)；而RAGE-Ab组和CTGF-Ab组BACE1、PS-1蛋白较AGE-BSA组表达减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结合免疫组化结果提示AGE部分通过RAGE及CTGF通路上调海马组织BACE1、PS-1的表达,影响Aβ生成。(4) AGE-BSA组IDE表达减少,明显低于NC组(P<0.01), RAGE-Ab组和CTGF-Ab组较AGE-BSA组表达增多(P<0.05)。提示AGE部分通过上调RAGE及CTGF表达抑制海马组织IDE的活性,减少Ap降解。结论1.糖基化终末产物(AGEs)通过与其受体(RAGE)结合促进转化生长因子β1(TGF-β1)的表达上调,进而导致海马区神经元内结缔组织生长因子(CTGF)的高表达。2.结缔组织生长因子(CTGF)可通过影响APP代谢酶(β-分泌酶、γ-分泌酶、胰岛素降解酶)的作用参与APP的异常代谢、促进Aβ42的生成。3.AGEs-RAGE-CTGF通路上调可能是海马区神经元损伤的重要途径,可能将成为阿尔茨海默病(AD)的又一发病机制。意义本研究拟用立体定位技术给大鼠双侧海马区内注射AGEs,建立AGEs动物损伤模型,用免疫组织化学和蛋白印迹法观察AGEs对CTGF、APP表达和Aβ生成的影响；并进一步阻断CTGF的上游信号分子RAGE及CTGF的作用,检测上述指标的变化,探讨AGEs通过作用其受体诱导CTGF表达及其与APP代谢、Aβ生成的相关性,为揭示AD发病机制及选择治疗靶点提供依据,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。