棉铃虫(Helicoverpa armigera)属于鳞翅目夜蛾科(Lepidoptera Noctuidae),在世界各地广泛分布,是我国和世界农业的主要害虫之一。昆虫神经肽促咽侧体素(allatotropin, AT)主要调控保幼激素的合成,进而调控昆虫的生长、发育及生殖。昆虫神经肽的受体主要为G蛋白偶联受体(GPCR),把胞外信号传递到胞内,对昆虫的生长、发育、生殖、免疫、代谢及行为等起重要的调控作用,GPCR -直是绿色农药研发最主要的药靶。因此,对棉铃虫的allatotropin的GPCR进行克隆和鉴定,为进一步把这些新型配体开发成控制棉铃虫生长发育的绿色农药建立基础。利用RACE方法,克隆获得棉铃虫allatotropin(Har-AT)受体基因(Har-ATR)全长cDNA序列,棉铃虫ATR的ORF为1341bp,编码466个氨基酸,5’端非编码区长236bp,3’端非编码区长341bp。棉铃虫ATR包含G蛋白偶联受体典型的7次跨膜结构域,与鳞翅目其他昆虫的ATR相一致。系统发育分析表明棉铃虫ATR与烟草天蛾ATR处于同一分支,且与烟草天蛾的氨基酸同源性为72.2%。利用定量PCR技术,明确了棉铃虫allatotropin及受体基因的组织分布和发育表达。Har-AT在胸腺中表达最高,其次是脑,在中肠与脂肪体中不表达。而Har-ATR在脑中表达量最高,在各组织均有表达。在脑组织中,Har-AT在蛹8天表达量最高,其次为蛹10天；Har-ATR在5龄幼虫第2天表达量最高,其次为蛹10天,与Har-AT发育表达模式稍有差别。构建并获得含Har-ATR的ORF的pcDNA5重组质粒(pcDNA5FRT-HATR),转染到CHO-WT11细胞株,与棉铃虫4种AT进行结合活性分析。4种AT与HATR均引起细胞内Ca2+水平的增加,呈现特异性的响应关系。Har-AT、 Har-ATL-Ⅰ、Har-ATL-Ⅱ、Har-ATL-Ⅲ的EC50值分别为6.9364x10-5 mM、2.8744×10-7mM、1.3061×10-6 mM和2.38×10-3 mM。上述结果证明我们克隆的Har-ATR是Har-AT的受体,Ca2+是Har-ATR的信号通路中的第2信使；与Har-ATR结合活性最高的为Har-ATL-I的,其次是Har-AT和Har-ATL-Ⅱ, Har-ATL-Ⅲ最低。考虑到细胞株对受体的鉴定影响较大,把pcDNA5FRT-HATR转染到HEK293细胞株中,4种Har-AT与HATR均引起细胞内Ca2+水平的增加,呈现特异性的响应关系；HEK293细胞株中结合的活性略低于CHOWT11细胞株,但是结合活性的顺序与CHOWT11细胞株一致。进一步测验是否配体与Har-ATR的结合激活,是否会导致细胞内cAMP水平的改变。把pcDNA5-Har-ATR或pcDNA5空质粒转染到HEK细胞株中,结果显示配体和Har-ATR结合后cAMP响应不明显,因此cAMP并非Har-AT激活Har-ATR的主要第2信使通路,Ca2+是Har-ATR的信号通路中主要的第2信使。前面的结果显示Har-ATR主要的配体是Har-ATL-Ⅰ、Har-AT和Har-ATL-Ⅱ,合成3个配体的C端的5个氨基酸模拟肽(命名为AT、ATL1和ATL2),利用CHOWT11细胞株检测3个模拟肽与HATR的结合活性。ATL1和HAR-ATR结合后引起的Ca2+的响应较弱,ATL1与Har-ATR结合的EC50值为2.16×10-3mM,与Har-ATLⅢ的结合活性相当,AT和ATL2与Har-ATR的结合更弱。因此,具有高结合活性的模拟肽设计和筛选工作还需要进一步开展。