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近年来,结核病在全球范围内又死灰复燃,成为传染病的首位杀手。全世界已有1/3人口约20亿人感染了结核菌,现有结核病人2000万,每年新发病人约900万,每年死亡人数高达300万。我国是世界上22个结核病高负担的国家之一,目前我国结核病患者数量居世界第二位,每年死亡13万人。卡介苗(BCG)仍是预防结核病的惟一可用疫苗,但其效果不够满意。研究认为BCG可预防儿童的结核病,但对成人肺TB的预防作用从0到80％不等。加之人口的流动、结核多重耐药菌株(MDR)的出现、与艾滋病的合并感染、以及多种社会经济因素,造成了诊断和治疗上的巨大困难,严重影响到结核病的控制。因此迫切需要研制更有效的结核疫苗。
本研究在已构建的三重表达新型结核DNA疫苗pVAX-siRNA-PVAE-IL-12的基础上,检测该疫苗所包含的结核分枝杆菌融合抗原基因Ag85B-ESAT6(PVAE)和人源白介素12(hIL-12)两个单元在哺乳动物细胞中的表达,检测该疫苗中靶向抗调亡基因Mcl-1L的siRAN单元能否正常启动转录并介导RNA干扰效应。从整体上验证疫苗框架构造的可行性,为进一步在动物水平研究该疫苗的免疫保护效果奠定了基础。
首先采用PCR方法,将抗原基因(PVAE)的终止密码子去掉,使其与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)融合克隆进质粒载体中,即在DNA疫苗pVAX-siRNA-PVAE-IL-12基础上,构建质粒pVAX-siRNA-PVAE-EGFP-IL-12。用其转染人胚肾细胞293,通过观察EGFP的荧光证实抗原在细胞水平的成功表达。
其次,将siRNA表达单元用靶向增强型绿色荧光蛋白基因EGFP的siRNA(siEGFP)取代,构建重组质粒pVAX-siEGFP-PVAE-EGFP-IL-12,将其转染293细胞。通过观察荧光标记证实siEGFP亦能显著抑制EGFP基因的表达。因此证明DNA疫苗中靶向Mcl-1L的siRNA单元亦可正常启动表达并介导RNA干扰效应。并通过ELISA法测定细胞培养液中hIL-12的表达,转染后48 h hIL-12的检出量为769.800 pg/mL细胞培养液,72 h检出量为991.901 pg/mL细胞培养液。
细胞实验成功验证抗原、hIL-12和siRAN共载体表达的结核DNA疫苗中能够在真核细胞中有效表达抗原、hIL-12并介导RAN干扰效应,为研究该DNA疫苗的防治与治疗效果打下基础。为研制优于BCG的更为有效的疫苗提供参考。这种方法的成功将为其它传染病的预防提供新思路和手段,具有普遍意义。