论文部分内容阅读
研究背景:干细胞(StemCell,SC)是生物体内各种成熟细胞的始祖细胞。近年来,干细胞越来越多地应用于类器官的研究。所谓类器官研究是指,利用合理设计的诱导方案,在3D环境中,将某种类型的干细胞向某个器官方向诱导,从而获得与人体某脏器的结构甚至是功能相似的类器官组织。类器官研究已经应用于药物毒性检测、遗传病研究等领域,但该研究的最终目的应该是用于人体病变脏器的替换。肾脏在高等生物体内主要起清除多余水分和有毒物质的作用,以调节生物体的内环境稳态。近年来,终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的发病率逐年提高,而血液透析和肾移植作为目前主要的医学手段,各自存在一定的缺陷。如果能够制备具有功能的肾脏类器官,将其应用于临床,则很有希望解决该问题。在各种干细胞中,胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)具有最高的多能性,虽然目前的研究水平可以从人类胚胎或生殖腺中获得ESC,但该做法存在严重的伦理性问题,且缺乏多样性,临床应用前景不佳。作为其替代方案,有研究者将Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc四个因子用基因载体导入人成纤维细胞内,获得了同样具有高度多能性的人类诱导多能干细胞(human Induced Pluripotent Stem Cell,hIPSC),而后者目前已经大量应用于肾脏类器官的相关研究。目前肾脏类器官的制备方案并无统一标准,我们在总结多个肾脏类器官制备方案的基础上,通过不断摸索和改进,设计了一套完整的肾脏类器官制备方案,最终获得肾脏类器官。研究目的:在体外利用hIPSC构建肾脏类器官。研究方法:首先由前文所述方法获得hIPSC,种植于培养瓶内进行2D培养,在培养获得一定细胞密度后,先后加入CHIR99021、FGF9因子对其进行为期6天的2D平面诱导;随后将细胞团转入Transwell小室内进行为期12天的3D立体诱导,最终获得肾脏类器官。我们在第1/3/6/11/18天于光镜下拍摄细胞状态图片,在上述时间点收集细胞内的蛋白,用于不同分化阶段标记物的检测,并将最终获得的肾脏类器官制作为石蜡切片,进行HE染色和免疫组化鉴定。研究结果:跟踪拍摄的光镜图片显示,2D平面培养下,加入生长因子后的hIPSC集落形成明显减少,其开始分散生长;在后续的3D立体培养中,类肾器官内部开始分化出管状结构。对第18天收获的肾脏类器官进行石蜡切片-HE染色,同样证明了此时肾脏类器官中有大量管状结构出现。进一步对管状结构进行的ECAD/PAX2/GATA3三种标记物的免疫组化鉴定发现,管状结构高度表达PAX2,低度表达ECAD,部分表达GATA3。对第1/3/6天收集的蛋白进行的数个标记物检测提示,随着诱导方案的进行,hIPSC的干细胞标记物表达量下降,而肾脏祖细胞(nephronic progenitor cell,NPC)标记物则呈上升趋势;对第1/3/6/11/18天蛋白进行的检测在证实了这一趋势的基础上,进一步发现随着诱导的进行,如PAX2、ECAD等肾小管和集合管的标记物也逐步开始表达。研究结论:利用我们设计的诱导方案,我们获得了含有大量管状结构的肾脏类器官,并推测该管状结构很可能是初级肾小管和初级集合管。