【背景】肥胖是高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭等多种心血管疾病发生发展的重要危险因素。瘦素(Leptin)是ob基因编码的产物,由脂肪细胞分泌入血,调节食欲和能量代谢。数项研究显示在体外瘦素能够直接作用于原代培养的新生大鼠心肌细胞和血管平滑肌细胞,诱导心肌细胞和平滑肌细胞肥大。我们之前的研究也证实在原代培养的新生大鼠心肌细胞,瘦素能够刺激内皮素-1(Endothelin-1, ET-1)分泌,并通过ET-1诱导心肌细胞肥大和细胞内氧活性物质(Reactive oxygen species, ROS)产生。但是,由于ETA受体拮抗剂ABT-627未能完全阻断瘦素诱导的心肌细胞肥大和ROS产生,这就提示仍然存在其他通路介导瘦素的作用。过氧化物酶体增生因子活化受体α(Peroxisome proliferator-activated receptorα, PPARα)在线粒体脂肪酸氧化丰富的组织如心脏,肝脏,骨骼肌等呈高水平表达。PPARα主要影响脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation, FAO)循环中3个关键步骤所涉及的基因表达:脂肪酸摄取/酯化,脂肪酸线粒体转运和线粒体β-氧化。最近的研究认为,PPARα作为心脏脂肪酸氧化的关键调控基因,决定了心脏功能障碍发展过程中的能量底物利用转换。动物实验研究发现,由STZ诱导的糖尿病模型和肥胖db/db小鼠,其心脏PPARα活性均明显增高;心脏过度表达PPARα(MHC-PPARα)导致糖尿病样的心肌肥厚。同时,一些临床研究也显示心力衰竭病人心脏脂肪酸摄取增加;终末期舒张性心肌病的病人,其心脏PPARα表达增高,脂肪酸代谢速率增加。尽管PPARα的外源性配体贝特类药物作为降血脂药物在临床上广泛应用,但根据FDA的报告,目前已经有50多种PPAR激动剂由于其心脏毒性等多种毒性作用而被终止使用。这些研究提示PPARα活化诱导的脂肪酸利用上调及对糖代谢的抑制作用能够引起心肌重构,造成严重的心肌病。瘦素,作为PPARα的内源性激动剂,在肝脏、脂肪组织等多种细胞和组织中通过活化PPARα调节能量代谢。因此,我们假设PPARα活化参与了瘦素诱导的心肌细胞肥大。本文用原代培养的新生大鼠心肌细胞进行实验,第一部分主要探讨PPARα活化与心肌细胞肥大的关系;第二部分研究PPARα活化在瘦素诱导心肌细胞肥大中的作用;并从分子水平研究瘦素对PPARα表达的调节作用及具体机制,初步探讨瘦素对心肌细胞脂肪酸代谢的调控作用及相关机制,从而为心肌肥大的机制研究提供新的思路和线索。第一部分PPARα活化与心肌肥大目的探讨PPARα活化与心肌细胞肥大的关系方法用原代培养的新生大鼠心肌细胞进行实验。构建腺病毒载体Ad-CMV-PPARα上调PPARα表达。分别用6.25-100μmol/L PPARα激动剂非诺贝特和腺病毒载体Ad-CMV-PPARα孵育心肌细胞,检测总RNA、胚胎型基因mRNA表达、蛋白合成速率和心肌细胞表面积等心肌肥大指标;同时用上述干预因素处理细胞,ROS敏感的荧光探针DCF-DA检测心肌细胞ROS含量的变化。结果1. PPARα激动剂非诺贝特(6.25-100μmol/L)能够浓度依赖性的增加心肌细胞总RNA含量;上调心肌细胞胚胎基因ANF mRNA表达;增加心肌细胞蛋白合成速率和心肌细胞表面积(6.25μmol/L组P>0.05,其余全部P<0.05);2.腺病毒载体Ad-CMV-PPARα特异性诱导心肌细胞PPARα持续高表达,能够上调心肌细胞胚胎基因ANF mRNA表达;增加细胞表面积和蛋白合成速率(P<0.05);3. PPARα激动剂非诺贝特(6.25-100μmol/L)能够浓度依赖性的诱导心肌细胞DCF-DA荧光强度增加(6.25μmol/L组P>0.05,其余全部P<0.05);小结1.心肌细胞PPARα过度活化诱导心肌细胞肥大。2.心肌细胞PPARα过度活化诱导心肌细胞ROS产生。第二部分PPARα活化介导瘦素诱导的心肌细胞肥大目的1.研究PPARα活化是否介导瘦素诱导的心肌细胞肥大;2.探讨瘦素对PPARα表达的调节作用及具体机制。方法1.分别用PPARα拮抗剂GW6471(0.01-10μmol/L)和RNAi方法抑制心肌细胞PPARα表达。GW6471(0.01-10μmol/L)与瘦素(100 ng/mL)共同孵育细胞72小时,检测总RNA、总蛋白、胚胎型基因mRNA表达、蛋白合成速率和心肌细胞表面积等心肌肥大指标变化;PPARαsiRNA转染后再加入瘦素(100 ng/mL)孵育细胞48小时,检测胚胎型基因ANF mRNA表达、蛋白合成速率和心肌细胞表面积等心肌肥大指标变化;2. GW6471(0.01-10μmol/L)与瘦素(100 ng/mL)孵育细胞4小时,用ROS敏感的荧光探针DCF-DA检测心肌细胞ROS含量的变化;PPARαsiRNA转染后瘦素(100 ng/mL)孵育细胞4小时,ROS敏感的荧光探针DCF-DA检测细胞ROS含量的变化;3.荧光定量PCR法、Western-blot法检测1-1000 ng/mL瘦素对心肌细胞PPARα表达影响;4.凝胶迁移电泳试验、DNA-binding ELISA法检测1-1000 ng/mL瘦素对心肌细胞PPARα活性影响;5.荧光定量PCR法检测瘦素对心肌细胞脂肪酸代谢酶M-CPT1、ACO、FAS、ACS mRNA表达和糖代谢酶GLUT-1、GLUT-4、PFK、PDK4 mRNA表达的影响;Western-blot法检测瘦素对心肌细胞AMPKα表达的影响;6. Western-blot法检测AMPK抑制剂Compond C(40μmol/L)对瘦素诱导PPARα表达的影响。结果1. PPARα拮抗剂GW6471(0.01-10μmol/L)浓度依赖性的抑制瘦素诱导的心肌细胞总RNA含量、总蛋白含量增加,胚胎型基因ANF mRNA表达增多,蛋白合成速率、心肌细胞表面积增加(0.01μmol/L组P>0.05,其余全部P<0.05);2. RNA干扰抑制PPARα表达能够抑制瘦素诱导的心肌细胞胚胎型基因ANFmRNA表达,抑制蛋白合成速率、心肌细胞表面积增加(P<0.05);3. PPARα拮抗剂GW6471(0.01-10μmol/L)和PPARαsiRNA抑制瘦素诱导的心肌细胞内DCF-DA荧光强度增强(0.01μmol/L组P>0.05,其余全部P<0.05)。4. 1-1000 ng/mL瘦素浓度依赖性的诱导PPARαmRNA和蛋白表达增加(P<0.05);浓度依赖性的上调PPARα活性(P<0.05);5. 100 ng/mL瘦素诱导心肌细胞脂肪酸代谢酶M-CPT1、ACO、FAS表达增高(P<0.05),调节糖代谢的酶GLUT-1、PFK表达降低(P<0.05),负向调节糖代谢的酶PDK4表达升高(P<0.05);瘦素诱导心肌细胞AMPKα、ACC磷酸化;1μmol/L PPARα拮抗剂GW6471、PPARαsiRNA能够抑制瘦素对脂肪酸代谢酶mRNA表达的上调(P<0.05);6. AMPK抑制剂Compond C(40μmol/L)抑制瘦素诱导的PPARα表达。小结1.抑制PPARα表达能够抑制瘦素诱导的心肌细胞肥大和ROS产生;2.瘦素能够浓度依赖性的诱导心肌细胞PPARα表达,上调其活性;3.初步证实瘦素能够活化AMPKα,促进心肌细胞脂肪酸代谢,抑制糖的代谢;4.瘦素可能通过活化AMPKα调控PPARα表达。全文结论1. PPARα过度活化诱导心肌细胞肥大和ROS产生;2. PPARα活化介导瘦素诱导的心肌细胞肥大和ROS产生;3.瘦素可能通过活化AMPKα调节心肌能量代谢;4.瘦素可能通过活化AMPKα调控PPARα表达