研究背景2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)和肥胖症经常与多种组织的脂毒性损伤有关。胰岛β细胞作为调节糖代谢的关键细胞极易受脂质水平升高和随之而来的脂毒性的影响。因此深入研究脂毒性对于胰岛β细胞的损伤及功能调控可以为T2DM治疗提供新的靶标。研究发现,线粒体凋亡途径的启动和内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激是介导胰腺β细胞脂毒性损伤的重要机制。然而,迄今为止关于胰岛β细胞脂毒性损伤的具体信号分子转导尚不清晰。据报道,内质网应激和线粒体损伤可以激活干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)-干扰素调节因子 3(Interferon regulatory factor3,IRF3)信号通路。STING 由跨膜蛋白 173(Transmembrane protein,TMEM1 73)编码,是一种胞质DNA传感器,在固有免疫中起着至关重要的作用。当病原体入侵细胞时,细胞内的环状GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)通过产生第二个信使cGAMP(环状GMP-AMP,cyclic GMP-AMP)来激活下游衔接子 STING。活化的 STING进而招募并磷酸化IRF3(Phosphorylated IRF3,P-IRF3)。P-IRF3入核,与靶基因(例如IFN-α,IFN-β)的启动子结合,从而促进炎症基因的表达。尽管以前的研究主要集中在STING信号通路在机体抵抗病毒入侵中的作用,新兴证据表明STING也可以识别其自身细胞核或线粒体受损而泄漏到胞质中的DNA。因此,STING在各种炎症性疾病、自身免疫性疾病甚至在肿瘤免疫中均起着重要作用。近期少量研究发现,STING及其下游信号分子IRF3在糖脂代谢异常中具有重要作用。我们之前的研究发现,高脂饮食的小鼠肝脏中STING-IRF3信号通路被激活,而STING和IRF3的基因沉默可逆转肝脏炎症、细胞凋亡以及葡萄糖和脂质代谢功能障碍。另有研究表明,在STING或IRF3敲除小鼠中,高脂饮食诱导的代谢功能障碍和胰岛素抵抗得到改善。但是,STING-IRF3通路是否在T2DM的胰腺β细胞中被激活,其是否参与T2DM胰腺β细胞脂毒性损伤过程目前尚不清楚。为了阐明STING-IRF3信号通路在脂毒性诱导的β细胞损伤中可能的作用,我们首先研究了 db/db小鼠胰岛中STING-IRF3信号通路的激活情况。体外实验应用高水平棕榈酸(Palmitic acid,PA)模拟脂毒性观察其对大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞STING-IRF3信号通路的影响,同时观察INS-1细胞的炎症反应、凋亡、胰岛素合成和分泌。然后,我们应用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)分别沉默了INS-1细胞中的STING和IRF3,以进一步探索STING-IRF3信号通路在脂毒性诱导的β细胞损伤中的作用。为进一步探究INS-1细胞内STING-IRF3信号通路可能的活化机制,我们分别利用STAT1以及CGAS的siRNA对其进行基因沉默进而观察STING-IRF3信号通路的变化。研究目的探究STING-IRF3信号通路与2型糖尿病胰岛β细胞脂毒性损伤的关系。研究方法(1)db/db小鼠糖代谢、脂代谢、胰岛功能评估。构建db/db 2型糖尿病小鼠模型,常规检测小鼠体重、体脂含量。GTT、ITT检测小鼠糖代谢。ELISA检测血清甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、血清胰岛素水平。(2)db/db小鼠胰岛STING-IRF3信号通路活化情况以及炎症、凋亡评估。免疫荧光半定量检测db/db小鼠与野生(wt)小鼠胰岛内STING蛋白的表达情况,并与胰岛素共定位。分离小鼠胰岛,提取组织蛋白,Western blot检测胰岛 STING、P-IRF3、IFN-β、炎症指标(P65、TNF-α、IL-1β)以及凋亡指标(BAX、cleaved Caspase3、caspase3、cleaved PARP、PARP)的变化。TUNEL染色观察胰岛β细胞的凋亡情况。(3)PA刺激对INS-1细胞炎症反应、凋亡以及胰岛素合成分泌功能的影响。Western blot 检测炎症指标 P65、TNF-α、IL-1 β以及凋亡指标 BAX、cleaved Caspase3、caspase3、cleaved PARP、PARP、胰岛素以及 PI3K、磷酸化的AKT(Phosphorylated AKT,P-AKT)的变化。TUNEL 染色检测 INS-1 细胞凋亡情况。免疫荧光检测细胞内胰岛素的含量。ELISA法检测糖刺激的胰岛素分泌情况。(4)PA诱导INS-1细胞STING-IRF3信号通路活化情况评估。INS-1细胞用浓度为0.5mmol/L的PA处理24小时。qPCR技术检测STING mRNA水平的变化。Western blot检测以下指标:STING、P-IRF3、IFN-β的变化。免疫荧光检测P-IRF3的核转位。IP技术检测STING与IRF3的结合。(5)验证STING是否参与PA介导的胰岛β细胞损伤。应用小干扰RNA对INS-1细胞的STING敲低,然后给予0.5mmol/L PA刺激24小时。Western blot技术检测 STING、P-IRF3、IFN-β、炎症指标 P65、TNF-α IL-1β以及凋亡指标 BAX、cleaved Caspase3、caspase3、cleaved PARP、PARP、胰岛素以及PI3K、P-AKT的变化。TUNEL染色检测INS-1细胞凋亡情况。ELISA法检测糖刺激的胰岛素分泌情况。(6)验证IRF3是否参与PA介导的胰岛β细胞损伤。应用小干扰RNA对INS-1细胞的IRF3敲低,然后给予0.5mmol/L PA刺激24小时。Western blot技术检测 STING、P-IRF3、IFN-β、炎症指标 P65、TNF-α、IL-lβ以及凋亡指标BAX、cleaved Caspase3、caspase3、cleaved PARP、PARP、胰岛素以及PI3K、P-AKT的变化。TUNEL染色检测INS-1细胞凋亡情况。ELISA法检测糖刺激的胰岛素分泌情况。(7)探究PA激活STING-IRF3信号通路的可能机制。应用小干扰RNA对INS-1细胞的STAT1敲低,然后给予0.5mmol/L PA刺激24小时。Western blot技术检测STING的变化。应用小干扰RNA对INS-1细胞的cGAS敲低,然后给予 0.5mmol/L PA刺激24 小时。Western blot技术检测 STING、P-IRF3、IFN-β、炎症指标 P65、TNF-α、IL-1β以及凋亡指标 BAX、cleaved Caspase3、caspase3、cleaved PARP、PARP、胰岛素以及 PI3K、P-AKT 的变化。研究结果1.db/db小鼠是一种具有明显的高脂血症的T2DM小鼠模型。db/db小鼠体重、体脂含量显著高于wt小鼠。GTT显示db/db小鼠糖代谢紊乱,胰岛β细胞功能损害。ITT实验证实db/db小鼠胰岛素抵抗。db/db小鼠TG、TC、FFA显著高于wt小鼠,而胰岛素含量低于wt小鼠。2.db/db小鼠胰岛β细胞内存在STING-IRF3信号通路的激活,同时伴随着胰岛的炎症与凋亡。免疫荧光显示,db/db小鼠胰腺β细胞中STING的水平明显上调。与wt小鼠相比,db/db小鼠胰岛中STING的mRNA和蛋白水平升高。磷酸化的IRF3和IFN-β的水平也高于野生型小鼠。此外,db/db小鼠的胰岛中p65和炎性标志物(如IL-1B和TNF-α)的表达高于wt小鼠。同时,在db/db小鼠的胰岛中凋亡标记物(BAX,c-Cas3/Cas3,c-PARP/PARP)升高。TUNEL染色还显示出显着的细胞凋亡。3.PA诱导INS-1细胞炎症反应、细胞凋亡以及胰岛素的合成和分泌受损。PA处理之后INS-1细胞的STING无论在mRNA水平还是在蛋白水平均有明显的上调。同时P-IRF3、IFN-β均上调。此外,PA处理上调了INS-1细胞的炎症指标(p65、IL-1β、TNF-α)与凋亡指标(BAX,c-Cas3/Cas3,c-PARP/PARP)。TUNEL染色显示凋亡细胞显着增加。PA处理后胰岛素合成也受到损害,同时PA抑制了 PI3K-AKT信号通路和GSIS。4.PA激活INS-1细胞中的STING-IRF3信号通路。PA处理24小时后,无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平,STING的表达均显着增加。同样,PA促进STING与其靶IRF3的结合并诱导IRF3磷酸化。此外,免疫荧光显示PA处理后更多的磷酸化IRF3易位到核中。STING-IRF3的下游靶蛋白IFN-β的水平也高于对照组。5.STING参与PA诱导的INS-1细胞脂毒性损伤。转染STING siRNA后,无论有无PA刺激,STING均被抑制,IRF3的磷酸化和IFN-β的水平得到抑制。通过抑制STING-IRF3信号通路,炎症因子和凋亡相关指标也更低。TUNEL染色还表明,STING敲低后细胞凋亡减少。此外,胰岛素合成,PI3K-AKT信号传导和GSIS受损也都得到了改善。6.IRF3参与PA诱导的INS-1细胞脂毒性损伤。随着IRF3的抑制,IFN-β的表达降低。炎性细胞因子和凋亡标记物的水平降低。TUNEL阳性细胞减少;并且PI3K-AKT途径以及胰岛素合成和分泌受损得以缓解。7.cGAS介导PA诱导的INS-1细胞STING-IRF3信号通路的激活。随着STAT1的基因沉默,STING的表达并没有明显的变化。而当cGAS被基因沉默后,炎性细胞因子和凋亡标记物的水平降低,并且受损的PI3K-AKT途径以及胰岛素合成得以缓解。研究结论STING-IRF3途径在T2DM的病理过程中参与了脂毒性诱导的胰岛β细胞损伤。STING-IRF3信号通路的激活可以通过诱导胰岛β细胞的炎症反应、凋亡进而影响胰岛素的合成与分泌。cGAS可能是介导PA诱导的INS-1细胞内STING-IRF3活化的关键,而转录因子STAT1对于INS-1细胞内STING的变化并无明显作用。