【摘 要】
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褐藻胶裂解酶是一种广泛存在于土壤、海洋等中的多糖裂解酶,它可以有效切割海带、巨藻、马尾藻等褐藻类植物细胞壁及细胞间质中的主要成分之一——褐藻胶中存在的β-1,4糖苷键,从而生成聚合度2-10的褐藻寡糖。肠道菌群作为所有动物肠道中不可或缺的一部分,其中存在着大量可以产褐藻胶裂解酶的菌株,在褐藻的代谢吸收中扮演着重要的角色。对这些菌株及其褐藻胶裂解酶基因的筛选鉴定,不仅可获取优良的褐藻胶裂解酶生产菌株
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（NO.2018YFA0901700）；
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褐藻胶裂解酶是一种广泛存在于土壤、海洋等中的多糖裂解酶,它可以有效切割海带、巨藻、马尾藻等褐藻类植物细胞壁及细胞间质中的主要成分之一——褐藻胶中存在的β-1,4糖苷键,从而生成聚合度2-10的褐藻寡糖。肠道菌群作为所有动物肠道中不可或缺的一部分,其中存在着大量可以产褐藻胶裂解酶的菌株,在褐藻的代谢吸收中扮演着重要的角色。对这些菌株及其褐藻胶裂解酶基因的筛选鉴定,不仅可获取优良的褐藻胶裂解酶生产菌株,更有利于进一步加深对肠道菌群的了解。本课题首先以海藻酸钠为唯一碳源从我国南北潮间带的单齿螺肠道中筛选得到一株高产褐藻胶裂解酶且安全性良好的菌株Vibrio sp.ML17（菌种保藏编号:CGMCC NO.20377）。其在海藻酸钠（5 g/L）、胰蛋白胨（5 g/L）、Na Cl（30 g/L）、p H 7-8、30℃的条件下10 h即可达到生长平台期,14 h达到最高产酶量,相比于其他已报道的产褐藻胶裂解酶菌株具有明显优势。对酶学性质分析结果证明其所产褐藻胶裂解酶酶活为26.31 U/m L;该粗酶的最适反应温度为40℃,在40℃和45℃具有一定的热稳定性;最适p H为7.5;5 m M的条件下,Na+、Ca2+对酶活有明显促进作用,Fe2+、Cu2+、Zn2+则有明显抑制作用。进一步的应用实验发现Vibrio sp.ML17能够有效降解褐藻,在对海带和马尾藻处理72 h后,其降解率可分别达到44.0%和38.9%。之后,本课题又从人体肠道菌群中的多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）的基因组中分析鉴定得到了潜在的褐藻胶裂解酶Bt Alg,同时对其进行了异源表达。分别构建了p ET-SUMO-Bt Alg和重组质粒p PIC-9k-Bt Alg,在大肠杆菌Rosetta（DE3）和毕赤酵母GS115中进行诱导表达褐藻胶裂解酶Bt Alg。同时对毕赤酵母诱导条件进行了优化,通过单因素实验及Box-Behnken响应面试验得到甲醇浓度1.22%、p H 7.41、诱导99 h的条件下蛋白产量最高,理论值可达0.347 mg/m L。对酶学性质分析结果证明其所产褐藻胶裂解酶酶活为38.11 U/mg;该粗酶的最适温度为60℃,在40℃-70℃均有良好的热稳定性;最适p H为7.5;在5 m M的条件下,除Na+对酶活有一定提高外,其他金属离子均会降低其活性,Cu2+、Fe2+的抑制作用尤为严重,Zn2+则会使酶完全失活。此外,本课题还对Bt Alg的蛋白结构以卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）来源的PL38家族褐藻胶裂解酶（PDB ID:3NFV）为模板进行了同源模拟,得到了置信度为100%的模拟结果,并通过Discovery Studio软件进行底物对接,预测得到其底物特异性为Poly M,最小底物降解单位为三糖,羧基上的负电荷被碱性氨基酸LYS97吸引,从而断裂糖苷键。综上所述,本研究通过菌株筛选、基因工程表达策略、发酵工艺优化以及蛋白模拟等方法,探究了不同物种肠道菌群来源的褐藻胶裂解酶,为进一步了解肠道菌群及其潜在的工业应用价值奠定了基础。
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