软枣猕猴桃采后生理及软化差异蛋白质组学和PG酶学性质

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 23次 | 上传用户:zyx271724361
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软枣猕猴桃[Actinidia arguta (Sieb. et Zucc.) Planch.ex Miq]是典型的亚洲本土野生猕猴桃,在中国东北千山地区每年六月初开浓郁芳香的花,果实着生于长有浓密、深绿色叶子的粗壮藤本植株上,富含Vc而不耐贮。本研究通过对鞍山地区软枣猕猴桃的适宜采收期及适宜采收成熟度,果实采后常温与低温贮藏的生理生化变化及贮藏效果,果实采后成熟软化过程中差异蛋白质表达和果实PG的提取纯化及酶学性质进行了研究,得出结论如下:(1)针对远距离运输和长期贮藏,采收成熟度宜选择在软枣猕猴桃果实硬度为20.0kg·cm-2左右,可溶性固形物含量6.00%,固酸比7:1,此时果实的冰点温度为-0.55~0.60℃;针对鲜食、鲜销或短距离运输,采收成熟度宜选择果实硬度为14.0kg··cm-2左右,可溶性固形物含量7.00%以上,固酸比达8:1。(2)软枣猕猴桃属于呼吸跃变型果实。常温20℃条件下,果实的各项生理生化指标变化趋势明显,软化腐烂速度较快,第8天腐烂率超过60%,贮藏期仅在一周以内。果实第3天出现乙烯高峰,第5天出现呼吸高峰,淀粉酶活性的上升和淀粉含量的下降呼应,果胶酶活性的上升和果胶物质的转化呼应,与硬度持续下降相关。内源性ABA含量升至最高值时,果实的硬度陡然下降;ABA含量平缓变化时,硬度下降平缓;ABA与呼吸强度的出峰时间规律尚不明显,与乙烯之间存在相互抑制作用,而ABA上升速率越快时,淀粉酶的上升速率越缓慢;反之亦然。(3)软枣猕猴桃低温0℃贮藏可以抑制软枣猕猴桃果实的呼吸强度并推迟呼吸高峰的出现,19天之后果实的品质趋于下降,贮藏期达25天。0℃贮藏可推迟乙烯高峰的出现并降低乙烯的释放量,延缓软枣猕猴桃果实采后可溶性固形物、可滴定酸、维生素C、单宁含量的变化趋势,并且降低可溶性固形物、可滴定酸、维生素C、单宁含量及香气成分的种类,对果实的品质有一定的影响。(4)利用双向电泳等蛋白质组学技术对软枣猕猴桃果实在成熟软化过程的差异蛋白进行研究与分析。从2-DE凝胶上均检测到分离的蛋白质点约1300个,获得39个表达量差异在2倍以上的差异蛋白,MALDI-TOF/MS质谱鉴定后,MASCOT检索共有5个蛋白点检索分数超过73分,为确定蛋白。通过生物学功能分析这些蛋白的功能分别与物质和能量代谢、转录和翻译、次生代谢、调控、细胞骨架相关。结合果实生理变化推测这些蛋白在果实成熟软化过程中的差异表达,与软化有一定的关系。(5)影响PG提取效果的因素依次为:缓冲液液离子浓度、DTT浓度、缓冲液pH。最优提取条件:以50mmol/LpH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液为提取液,加入0.1mol/L NaCl、1.0mmol/LDTT提取效果为最佳。PG最适活性分析条件为反应温度40℃、反应时间90min。加0.12%CMC-Na,采用饱和度为30%-80%的硫酸铵分离PG,纯度提高了2.97倍;经过CM Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G-75柱层析分离纯化得到20.5倍的PG,得率达14.81%。纯化后的PG最适反应温度为40℃,在30-50"C范围内酶活力维持在较高的水平;在30-40℃范围内酶有较好的热稳定性,随着温度的升高,酶的热稳定性下降,在60-70℃处理1h,PG几乎完全失去活力。PG最适pH值为5.5,在pH4.5-6.5的条件下保存酶活力相对处于比较稳定的状态;PG的米氏常数为27.31mg/mL。(6)影响PG酶活的因素:随着EDTA浓度上升酶活而下降,当EDTA浓度高于2mmol/L时,EDTA对PG活力具有抑制作用。金属离子K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+具有激活作用,激活强弱依次为:Mg2+、Fe3+、K+、Fe2+、Ca2+;金属离子Cu2、Zn2+、 Mn2+、Ba2+、Al3+对酶具有抑制作用,抑制强弱依次为:Al3+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、 Zn2+。PG经过GA、IAA、ABA和ZT处理后发现,GA对酶活力有抑制作用,且随着浓度的升高,抑制作用逐渐增大。当ZT浓度为0.1mg/mL时,PG的活力比对照升高了1.87%;当ZT浓度分别为0.15.0.2mg/mL时,PG的活力比对照分别下降了2.32%、6.26%,抑制作用增强,说明ZT浓度越高反而抑制了PG的活力。从不同浓度的ABA处理效果来看,各浓度的ABA都可以不同程度的促进PG的活力,当ABA浓度为0.2mg/mL时,PG的活力比对照升高了5.71%;当ABA浓度为0.3mg/mL时,PG的活力高于对照0.98%。从不同浓度的IAA处理效果来看,各浓度的IAA都可以不同程度的抑制PG的活力。
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