上皮性卵巢癌的发生是表遗传学与遗传学机制共同参与的涉及多基因改变、通过多阶段变异累积形成的病理过程。目前，在其发生机制中，DNA启动子区CpG岛异常甲基化是一个研究热点。表遗传学是研究没有DNA序列变化、可遗传的基因表达的改变，表遗传学的分子机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质改型和RNA干涉等，它们在基因转录调控过程中起重要作用。作为表遗传学机制的重要内容，DNA甲基化是基因突变及缺失之外肿瘤抑制基因失活的第三种机制，DNA甲基化异常在多种肿瘤的发生中起重要作用。已有研究表明，肿瘤中异常甲基化的基因包括参与细胞周期调控、细胞分化、凋亡调控及肿瘤转移和血管生成相关基因等。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是表遗传学调控基因表达的两种主要方式，DNA低甲基化和组蛋白乙酰化可促进基因表达，DNA高甲基化和组蛋白去乙酰化可抑制基因表达，DNA甲基化和组蛋白乙酰化相互影响。卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，上皮性卵巢癌占卵巢恶性肿瘤85％-90％，DNA甲基化在上皮性卵巢癌的发生、发展中起重要作用。若干肿瘤抑制基因启动子区异常甲基化与上皮性卵巢癌的形成密切相关，研究表明，DNA甲基化酶抑制剂及组蛋白脱乙酰基酶抑制剂可能用于恶性肿瘤的临床治疗，包括上皮性卵巢癌在内。对肿瘤抑制基因启动子区异常甲基化的深入研究不仅有助于揭示上皮性卵巢癌的发生机制，而且可能促进上皮性卵巢癌临床诊断和治疗的发展。本研究旨在探讨上皮性卵巢癌与表遗传学的关系，选择与细胞凋亡、细胞周期调控、DNA修复及化疗耐药相关的基因RASSF1A、BRCA1、p16、hMLH1及MGMT，研究的第一部分首先通过检测基因启动子区CpG岛甲基化状态及其蛋白表达，寻找上皮性卵巢癌相关的异常甲基化基因，进一步分析基因蛋白表达及与启动子区甲基化的相关性，及与临床病理学特征的关系。研究的第二部分从与遗传学发生机制相结合的角度，分析上皮性卵巢癌组织中MSI状态，以及上述抑癌基因启动子甲基化及蛋白表达与MSI之间的相关性，探讨MMR基因hMLHl启动子甲基化与MSI的相关性以及在上皮性卵巢癌发生及发展中的作用。研究的第三部分以前两部分的实验结果为基础，选择甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR及脱乙酰基酶抑制剂NaB两种药物，在观察卵巢癌细胞系生长抑制的同时，分析五个抑癌基因启动子区CpG岛甲基化状态、mRNA及蛋白表达的改变，探讨药物调控的意义及潜在的临床应用价值。材料与方法一、实验材料中国医科大学附属第一医院妇科、辽宁省肿瘤医院妇科1999-2006年手术治疗63例原发散发性上皮性卵巢癌组织、41例相应的盆腹腔转移灶、10例癌旁卵巢组织及20例正常卵巢组织；上皮性卵巢癌细胞株：CAOV3及OVCaR3(中国医科大学细胞生物教研室)，HO-8910(上海肿瘤细胞研究所)，A2780(天津血液病学研究所)：RNA提取试剂TRIZOL Reagent(GIBCO BRL公司)，甲基化酶抑制剂5-aza-2’-deoxycitydine(5-Aza-CdR)及脱乙酰基酶抑制剂Sodium Butyrate(NaB)(Sigma)，RT-PCR试剂盒(TaKaRa)，Wizard DNA Clean-up(Promega公司)，Annexin-v-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)，RASSF1A羊抗人多克隆抗体、BRCAl兔抗人多克隆抗体、P16鼠抗人单克隆抗体(Santa cruz)，hMLHl兔抗人单克隆抗体及MGMT鼠抗人单克隆抗体(Neomarkers)。二、实验方法1 MSP法检测基因启动子区的甲基化状态2应用MTT法检测上皮性卵巢癌细胞株的增殖活性3流式细胞术检测细胞周期，Annexin V-FITC染色法检测细胞凋亡率4 RT-PCR法及Western-blot法检测基因mRNA及蛋白表达。5 PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染色法检测卵巢组织MSI状态。三、统计分析采用SPSS11.5统计软件进行分析，率的比较采用X~2检验和Fisher精确概率法；采用Spearman等级相关系数分析相关性；均数统计分析方法为方差分析，两两比较采用LSD法。结果第一部分上皮性卵巢癌多肿瘤抑制基因启动子区异常甲基化及蛋白表达的研究1上皮性卵巢癌组织原发灶及盆腹腔转移灶中RASSF1A、BRCA1、p16、hMLH1及MGMT基因启动子区甲基化发生率在原发灶及转移灶中分别为49.2％、25.4％、20.6％、15.9％、11.1％及58.5％、26.8％、22.0％、12.2％、9.8％，在RASSF1A、BRCA1及p16中显著高于正常卵巢组织(P＜0.05)。2上皮性卵巢癌组织原发灶及盆腹腔转移灶RASSF1A、BRCA1、p16、hMLH1及MGMT蛋白表达率分别为31.7％、28.6％、23.8％、27.0％、44.4％及29.3％、31.7％、22.0％、24.4％、48.8％，显著低于正常卵巢组织及癌旁卵巢组织(P＜0.05)，蛋白表达与其启动子区甲基化之间存在相关性，表明基因启动子区CpG岛异常甲基化是其蛋白失表达的机制之一。3 RASSF1A基因启动子区甲基化发生与上皮性卵巢癌临床分期和细胞分化程度相关，多发生在临床Ⅲ、Ⅳ期和低分化者(P＜0.01)。4上皮性卵巢癌中存在CpG岛甲基化表型，与CIMP阴性癌相比，在不同临床期别、分化程度及病理类型间差异无统计学意义(P＞0.05)。5上皮性卵巢癌中可能有2种不同甲基化类型肿瘤，一组易发生RASSF1A、hMLH1甲基化；另一组易发生BRCA1、p16，可能还包括MGMT的甲基化。第二部分上皮性卵巢癌微卫星不稳定性与肿瘤抑制基因异常甲基化的研究1上皮性卵巢癌组织存在MSI，MSI-H发生率在原发灶及盆腹腔转移灶中分别为22.2％及19.5％，两者之间无统计学差异(P＞0.05)。2上皮性卵巢癌原发灶中MSI-H发生率在粘液性癌(38.9％)显著高于浆液性癌(8.8％)(P＜0.05)，在非浆液性癌组(37.9％) (粘液性癌、内膜样癌及透明细胞癌)显著高于浆液性癌组(P＜0.01)。3上皮性卵巢癌中hMLH1基因启动子区异常甲基化导致的蛋白失表达与MSI-H密切相关(P＜0.01)。第三部分联合应用5-Aza-CdR及NaB调控卵巢癌细胞TSG去甲基化及表达的实验研究1 5-Aza-CdR及NaB抑制四株上皮性卵巢癌细胞增殖，联合用药抑制作用增强。2 5-Aza-CdR及NaB处理后四株上皮性卵巢癌细胞呈现G1期阻滞，联合用药阻滞作用增强。3 5-Aza-CdR及NaB诱导四株上皮性卵巢癌细胞凋亡率显著增加，联合用药细胞凋亡率显著高于单独用药。4 5-Aza-CdR使四株上皮性卵巢癌细胞中异常甲基化基因呈去甲基化状态，使其中部分基因，包括CAOV3中p16基因，OVCAR3中RASSF1A和MGMT基因，A2780中BRCA1基因，以及HO-8910中p16和MGMT基因去甲基化伴随mRNA表达及蛋白表达上调。5 NaB使OVCAR3中RASSF1A基因、CAOV3及HO-8910中p16基因甲基化减弱，伴随mRNA表达及蛋白表达部分上调。6 5-Aza-CdR与NaB联合用药使上述异常甲基化基因呈完全去甲基化状态，诱导A2780中hMLH1 mRNA及蛋白重新表达，使OVCAR3中RASSF1A基因、HO-8910及CAOV3中p16基因mRNA及蛋白表达较单独用药上调。结论1上皮性卵巢癌组织中RASSF1A、BRCA1、p16、hMLH1及MGMT基因启动子区异常甲基化与其发生发展相关。2上皮性卵巢癌组织存在MS1，MSI-H与非浆液性癌类型，尤其是粘液性上皮性卵巢癌发生发展密切相关。上皮性卵巢癌中MSI-H机制部分在于hMLH1基因启动子区异常甲基化。3 5-Aza-CdR能逆转RASSF1A、BRCA1、p16、hMLH1及MGMT基因异常甲基化状态，调控其中部分基因的表达。4 NaB与5-Aza-CdR对上述基因去甲基化及表达调控具有协同作用。5 5-Aza-CdR与NaB具有协同抑制上皮性卵巢癌细胞增殖的作用，可能与阻滞细胞周期、诱导凋亡及上调RASSF1A、p16及BRCAl基因的表达有关。