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第一部分含人肝细胞生长因子基因的腺病毒载体的构建及病毒体外感染骨髓间充质干细胞目的构建含人全长肝细胞生长因子（human hepatocyte growth factor,hHGF）基因与绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）基因融合的腺病毒表达载体pDC316-HGF-IRES-EGFP，经293细胞包装，同源重组产生重组腺病毒Ad-HGF。病毒液感染骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs），研究病毒感染效率，以及hHGF基因在BM-MSCs中表达情况。方法将人全长HGF cDNA亚克隆入腺病毒质粒载体pDC316-IRES-EGFP-Laczα，建立含hHGF基因的腺病毒表达载体pDC316-HGF-IRES-EGFP，采用酶切法、PCR法和测序法分别鉴定。采用同源重组法获得含hHGF的重组腺病毒Ad5-HGF-IRES-EGFP（简写为Ad-HGF）。用CsCl密度梯度超离心法纯化病毒，用空斑形成试验进行病毒滴度测定。体外分离、培养BM-MSCs。以仅表达GFP基因的重组腺病毒Ad5-IRES-EGFP（简写为Ad-GFP）为对照，体外分别以Ad-GFP，Ad-HGF感染MSCs。荧光显微镜下观察MSCs有无GFP基因表达；用荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activated cell sorter，FACS）检测受染细胞的GFP标记以判定hHGF表达。酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测转导细胞培养上清中hHGF表达的浓度和持续时间。感染Ad-HGF，Ad-GFP的MSCs细胞分别命名为HGF／MSCs，GFP／MSCs。结果腺病毒表达载体pDC316-HGF-IRES-EGFP经限制性内切酶切电泳后显示有2.3kb的hHGF目的基因片段和5.2kb的线性化pDC316-IRES-EGFP载体片段，显示构建的腺病毒表达载体中含有hHGF基因；目的片段测序结果与Gene bank中hHGF cDNA序列一致。经293包装所产生病毒Ad-HGF，纯化后滴度可以达到5.0×1011pfu／mL。荧光显微镜下观察到HGF／MSCs，GFP／MSCs细胞都有GFP基因表达。HGF／MSCs细胞培养上清中hHGF水平升高，能持续表达hHGF大约14天；最高浓度达到103ng／mL。结论本实验中腺病毒表达载体构建正确；重组腺病毒液Ad-HGF滴度高；转导MSCs后在MSCs中获得高效、稳定和持续表达的hHGF。该载体达到实验设计要求，为其在进一步的体内、外研究奠定了物质基础。第二部分HGF／MSCs促进小移植肝再生的实验研究目的建立大鼠原位30％小体积肝移植模型，并在此基础上进一步了解大鼠行同种原位减体积肝移植后，经门静脉输注表达hHGF的骨髓间充质干细胞（HGF／MSCs），研究其对移植后小移植肝的保护作用。方法（1）采用Lewis大鼠，改良“二袖套法”建立大鼠30％肝移植模型，分别称取受体肝脏重量及供肝重量。术后1，3，5，7天处死大鼠，称取肝脏重量并取肝组织行组织学检查，了解移植后肝脏再生的初步情况。（2）在模型建立的基础上，将受体分为4组，每组5只，实验组在供肝植入、门静脉开放后，立即经门静脉输注5×106 HGF／MSCs。对照组则分别输注相同体积的生理盐水，5×106 GFP／MSCs，或1.0×109 pfu Ad-HGF（以上都定容至1mL）。分别于术后1，3，5，7天在实验组和对照组中各随机抽取5只大鼠处死。取血检测血清ALT。记录移植物湿重。取肝组织用免疫组化法检测肝细胞凋亡和增殖活性，或行相关的分子生物学实验。结果（1）对照组大鼠30％肝移植模型7天存活率33.3％。而实验组大鼠生存率为73.3％；（2）对照组移植物组织学检查示术后1天中央静脉以及肝窦扩张、部分肝细胞增大气球样变，3天和5天组可见汇管区单核细胞浸润多；而实验组肝脏结构损伤轻，炎性细胞浸润少，二倍体和多倍体肝细胞多见；（3） HGF／MSCs输注的大鼠在术后3天和5天时血ALT水平较对照组明显降低；（4）实验组移植物湿重在术后3天和5天时较对照组明显增加；（5）术后3天和5天实验组大鼠的肝移植物中增殖和凋亡细胞明显较对照组高；（6）实验组大鼠28天生存率较对照组高，且移植肝肝纤维化发生率低。结论（1）大鼠原位部分肝移植是研究肝再生的良好实验模型，移植肝仍具有良好的增殖活性；（2）大鼠部分肝移植后，输注HGF／MSCs能够保护肝细胞和移植物，促进肝功能的恢复，提高7天生存率；（3）HGF／MSCs输注能够明显促进大鼠部分肝移植后供肝的再生；（4）HGF／MSCs能够维持移植肝的正常结构，提高长期生存率。