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甜叶菊是菊科（Compositae）斯台维亚属草本植物,作为一种兼具糖用和药用价值的植物日益引起人们的关注和重视。其主要成分甜菊糖苷（SGs）为混合物,目前已从甜叶菊中分离得到了 18种糖苷,其中莱鲍迪苷A（Rebaudioside A,RA）、甜菊苷（Stevoiside,ST）和莱鲍迪苷C（RebaudiosideC,RC）相对含量较高,不同种类的甜菊糖苷甜度和口感不尽相同。提高总糖苷含量,以及有针对地提高某种糖苷如莱鲍迪苷A（Rebaudioside A,RA）在总糖苷中的比例,是甜叶菊的育种趋势。尽管甜叶菊糖苷生物合成途径中关键酶基因已陆续被克隆,但更多甜菊糖苷合成相关基因,尤其是甜叶菊糖基转移酶基因需进一步挖掘。目前来看,甜叶菊基因组和转录组信息比较缺乏。因此,本研究采用Illumina/Solexa测序技术对3种不同糖苷含量的甜叶菊品系进行转录组测序和基因表达差异分析,在此基础上进行其微卫星位点的搜索,开发分子标记,为今后辅助选育优质高产甜叶菊新品种奠定基础;此外,已有大量研究表明,水杨酸（SA）可以诱导植物次生代谢产物的产生,本研究通过外源喷施适宜浓度的SA,探讨其对甜叶菊部分生理生化指标、糖苷含量及糖苷生物合成途径中关键酶基因的影响,并采用数字基因表达谱分析筛选出SA处理下的差异表达基因,从而进一步探索甜叶菊对水杨酸信号的响应机制及其信号转导途径。主要试验结果如下:本试验对3份不同的甜叶菊品系SR1、SR2及SR3进行叶片转录组测序,不同品系其糖苷含量存在差异,特别是甜菊糖苷（ST）与莱鲍迪苷A（RA）,SR1、SR 2及SR 3材料中ST含量分别为2.19%、12.87%及1.23%;其RA含量分别为6.91%、0.02%及 9.35%。经过 Illumina HiSeqTM 2000 上机测序后,SR1、SR 2 和SR3 分别获得 60,113,164、66,869,210 和 58,857,260 个 clean reads,经组装,比对得到 80,160 个 unigenes。分析上述3份不同甜叶菊品系的数字基因表达谱,结果发现SR1与SR2间的636个差异基因主要富集于95个路径,其中注释到代谢途径（metabolic pathways）的差异表达基因的数目最多。SR1与SR 3间的2,464个差异基因主要富集于179个路径,其中次生代谢（secondary metabolites）的差异表达基因的数目最多。SR2与SR3间的2,041个差异基因主要富集于189个路径,其中代谢途径的差异表达基因的数目最多,其下调及上调最显著的pathways分别为是次生代谢和代谢途径。分析还发现有161个注释为UDP糖基转移酶（UGTs）的unigenes,其中包括已经进行功能验证的糖基转移酶基因UGT85C2,UGT74G1和tUGT76G1。SR1、SR2的大部分UGTs表达量较高,SR2中约有1/3的UGTs表达量相对较低。甜叶菊转录组中存在丰富的微卫星（SSR）位点。在甜叶菊80 160条unigenes中搜索到10 070个SSR位点,平均分布距离5.41 kb,发生频率为12.56%。在发现的60种碱基重复模式中,（A/T）n出现的频率最高（54.61%）,其次是（ATC/ATG）n（9.71%）和（AT/AT）n（8.03%）。挑选20对引物对12个品系甜叶菊的cDNA进行SSR-PCR扩增,扩增产物均具有多态性,有效扩增率100%。通过聚类分析表明,相关结果与试验品系的来源存在一定关系。在喷施2mmol/L SA后,结果发现甜叶菊SR1品系的RA、ST、RC含量均有不同程度增加,总苷（RA+ST+RC）含量于24h时达到最大值17.2%,较CK处理含量增加5.48%,差异达极显著水平;随着处理时间的延长,总苷含量增长较缓慢。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析表明,SA对已报道参与合成甜叶菊糖苷的15个基因的表达量均具一定的影响,作为甜叶菊糖苷合成特有的基因tUGT85C:2、CUGT74G1、UGT76G1均于SA喷施9h时达到最大值。在处理后期,UGT85C2、UGT76G1的表达量与CK接近,而UGT74G1的表达量极显著高于CK。上述试验结果表明,SA可通过调控甜叶菊糖苷合成途径关键酶基因,从而影响甜叶菊糖苷合成。采用2mmol/LSA处理甜叶菊SR1品系后还发现,过氧化氢酶（CAT）活性呈“S”变化,过氧化物酶（POD）,超氧化物歧化酶（SOD）活性及过氧化氢（H2O2）含量呈峰形变化。在诱导早期,即处理0-3h时以CAT活性下降,SOD活性增加为主;H2O2含量于处理9h达到峰值,处理9-24h时POD酶在H2O2含量上升后,酶活迅速增大以维持甜叶菊体内H2O2含量稳定。另外,SA处理后甜叶菊内源SA含量在3h迅速积累;随着处理时间的延长,内源SA含量逐渐降低。与SA合成相关的基因ICS-7和PAL-7的表达量分别于3h、9h达到最大值,与对照相比分别増加1.45、1.82倍。SA介导的抗病反应的关键调控因子NPR1-4在SA喷施1.5h后基因表达量水平提高,与对照相比增加2.65倍,于24h达到最大值,与对照相比增加4.72倍。本试验还测定了甜叶菊钙调蛋白基因CaM1和CaM2的表达量,结果表明SA喷施后二者表达量均迅速增长,于9h达最大值,分别为对照的2.29和2.17倍,与CK间差异极显著。分别将SA以及蒸馏水（对照）处理9小时的甜叶菊SR1品系叶片进行表达差异基因研究。结果表明,CKleaf和SAleaf样品经测序共分别获得15,004,886和13,698,145个clean reads;将Trinity拼接得到的甜叶菊转录组作为参考序列（ref）,将每个样品与ref做比对,CK leaf和SAleaf样品分别有11,967,707和12,112,709个cleanreads个比对上参考基因。比较SA leaf与CK leaf发现了 170个差异表达基因,其中有52个基因上调表达,118个基因下调表达;KEGG功能显著性富集分析比对结果显示SAleaf与CKleaf间有86个差异基因主要富集于72个pathways,其中76个差异基因下调,10个差异基因上调。进一步通过KEGG功能显著性富集分析发现,脱落酸（ABA）合成的胡萝卜素裂解酶4和β-糖苷水解酶同源基因在SA处理的叶片中均上调,从表达谱数据中分析ABA合成途径中关键酶玉米黄质环氧化酶（zeaxanthin epoxidase,ZEP）,9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxyearotenoid dioxyenase,NCED）;短链醇脱氢/还原酶（short-chain alcohol dehydrogenase/reduetase,SDR）的同源基因表达情况,结果表明,在甜叶菊中分别有5、18及24个基因功能被注释为ZEP、NCED及SDR;在SA处理9h后,有3个ZEP基因上调。18个功能被注释为NCED基因较CK有12个基因表现为上调。24个功能被注释为SDR基因较CK有18个基因表现为上调。采用RT-qPCR验证ZEP、NCED及SDR在甜叶菊叶片中的动态变化,SA喷施后1.5h时,3个基因的表达量均较对照略微下降,于9h达到较高水平,其中NCED-1与ZEP-7分别较对照增加3.73、2.18倍,结果证明SA处理诱导了甜叶菊ABA基因的变化。据此,SA可能进一步通过介导ABA途径来完成在甜叶菊中的信号转导,但ABA途径否与甜叶菊糖苷生物合成有关或具体如何调控甜叶菊还有待进一步试验确认。综上,本研究结果为利用生物技术和分子标记育种提高甜叶菊糖苷含量提供了良好的理论依据,为理解甜叶菊糖苷含量及相关基因表达与水杨酸之间的关系奠定了良好的基础。