胃癌作为消化道常见的恶性肿瘤,多因胃上皮细胞的恶性转化而发生,是世界上第四大恶性肿瘤。2012年,全球新出现的胃癌患者在94万左右,其中至少有70万人因胃癌而死亡。胃癌的诱发因素十分复杂,幽门螺杆菌的定植,肥胖,特异性的饮食习惯等都可能是胃癌发生的原因,其早期症状不明显,大多数患者确诊时就处于肿瘤转移的中晚期治疗阶段,中位生存时间多在4-11个月,5年生存率则让人难以接受,还不足10%。虽然几年来早期诊断方法如内镜诊断和影像学诊断,以及治疗方法取得了许多革新,患者的整体存活率有所改善。但远处转移性胃癌患者的治疗仍面临巨大挑战,晚期胃癌患者的死亡多归因于腹膜种植,血行转移和淋巴结转移,因而,有必要探讨胃癌进展的作用机制,阐明胃癌细胞增殖、侵袭等生物学过程的发生原理。大量研究表明,非编码RNA对于胃癌的演变不可或缺。非编码RNA是不编码蛋白质,基于长度,非编码RNA被分成了不同的类别。大RNA包括长的非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),小核仁RNA,环状RNA,tRNA和rRNA,其长度都大于50核苷酸。小RNA包括微小RNA(microRNA,miRNA),siRNA和piRNA,其长度均小于50核苷酸。目前,miRNA在胃癌中扮演的角色逐渐被研究者们所揭示。最近,miR-338-3p被发现在乳腺癌、肝细胞癌等癌症中出现异常的低表达,外源性的miR-338-3p的人为表达可造成癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力发生显著改变。目前还没有研究就miR-338-3p在胃癌中的作用和分子机制进行确切的报道,为此本研究将胃癌患者的临床组织标本和体外培养的胃癌细胞作为研究对象,对miR-338-3p在胃癌中的表达和功能进行了分析,结合生物信息学和双荧光素酶报告实验寻找miR-338-3p的下游靶基因,以探明胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的可能生物学机制,为miR-338-3p作为预测胃癌转移的分子标志和相关胃癌治疗靶向药物的开发提供理论基础。本研究主要包括:第一章MIR-338-3P在胃癌中的表达及功能分析目的:探究miR-338-3p在胃癌细胞、组织中的表达情况,分析miR-338-3p对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:选择于2016年2月至2018年3月在宜宾市第一人民医院医院接受手术的31例胃癌患者,收集胃癌组织和相应的邻近组织(距肿瘤组织≥5cm)的标本;体外培养GES-1,MGC-803,HGC-27,MGC-803,SGC-7901,BGC-823细胞系。qRT-PCR检测胃癌细胞、组织和正常胃粘膜细胞、组织中miR-338-3p表达差异,以对照mimics,miR-338-3p mimics转染胃癌细胞,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。结果:1、胃癌组织中miR-338-3p的表达较正常胃黏膜组织下调(P<0.05),胃癌细胞系MGC-803,HGC-27,MGC-803,SGC-7901,BGC-823中miR-338-3p的表达水平显着低于GES-1胃粘膜上皮细胞(P<0.05);2、miR-338-3p mimics转染后HGC-27细胞,miR-338-3p的表达水平显着增加(P<0.05);3、与miR-con组相比,培养48h及72h时,miR-338-3p组的细胞增殖活性显着降低(P<0.05);4、与miR-con组相比,miR-338-3p组能促进细胞的凋亡(P<0.05);5、与miR-con组相比,miR-338-3p组HGC-27细胞迁移和侵袭能力显着下降(P<0.05)。结论:miR-338-3p在胃癌细胞、组织中较正常胃粘膜细胞、组织明显下调,miR-338-3p上调,可促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第二章MIR-338-3P靶基因的生物信息学分析及功能验证目的:寻找miR-338-3p的下游靶基因,并分析其对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:选择于2016年2月至2018年3月在宜宾市第一人民医院接受手术的31例胃癌患者,收集胃癌组织和相应的邻近组织(距肿瘤组织≥5cm)的标本;体外培养GES-1,MGC-803,HGC-27,MGC-803,SGC-7901,BGC-823细胞系。结合生物信息学预测结果选定SIRT2是miR-338-3p的候选靶基因,qRT-PCR、Western blot检测胃癌细胞、组织和正常胃粘膜细胞、组织中SIRT2 mRNA、蛋白表达差异,直线回归分析SIRT2表达与miR-338-3p表达的相关性,以对照mimics,miR-338-3p mimics转染胃癌细胞,qRT-PCR、Western blot检测胃癌细胞SIRT2 mRNA、蛋白表达,双荧光素酶报告实验检验miR-338-3p是否能直接调控SIRT2,人为沉默SIRT2表达,MTT实验检测胃癌细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。结果:1、SIRT2在胃癌组织中mRNA表达较正常胃黏膜组织明显升高(P<0.05),Western blot实验也证实SIRT2蛋白表达在胃癌组织中明显升高;2、SIRT2的表达水平与miR-338-3p负相关(r2=0.1017,P<0.05);3、miR-338-3p组SIRT2mRNA表达较相应对照明显降低,anti-miR-338-3p组SIRT2mRNA表达则较相应对照明显升高(P<0.05),Western blot检测SIRT2蛋白表达也出现类似结果;4、在双荧光素酶报告基因实验中,野生型SIRT2 3’-UTR与miR-338-3p mimics共转染后荧光素酶活性显着降低(P<0.05),但SIRT2 3’-UTR突变体与miR-338-3pmimics共转染后,荧光强度不明显变化(P>0.05);5、与si-con组相比,培养48h及72h时,SIRT2组的细胞增殖活性显着降低(P<0.05);6、与SIRT2组比较,si-SIRT2组能促进细胞的凋亡(P<0.05);7、与si-con组相比,si-SIRT2组HGC-27细胞迁移和侵袭能力显着下降(P<0.05)。结论:SIRT2是miR-338-3p直接调控的下游靶基因,其表达在胃癌细胞、组织中较正常胃粘膜细胞、组织明显上调,SIRT2下调,可促进胃癌细胞凋亡,可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第三章MIR-338-3P调控胃癌细胞迁移和侵袭的分子机制目的:进一步分析miR-338-3p/SIRT2功能轴对胃癌增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用,探究Wnt/β-catenin信号通路对于miR-338-3p/SIRT2调控的反应性。方法:以mimics con,miR-338-3p mimics,inhibitor con,miR-338-3p inhibitor,对照siRNA,SIRT2 siRNA,miR-338-3p mimics和pcDNA 3.1空载体,miR-338-3p mimics和pcDNA 3.1-SIRT2过表达载体转染HGC-27细胞中并分别标记为miR-Con组,miR-338-3p组,anti-miR-con组,anti-miR-338-3p组,si-con组,si-SIRT2组,miR-338-3p+Ctrl组和miR-338-3p+SIRT2组,qRT-PCR检测各组细胞miRNA表达,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot实验检测蛋白表达。结果:1、转染miR-338-3p mimics后,胃癌细胞SIRT2表达较miR-con组明显降低(P<0.05),共转染pcDNA 3.1空载质粒的miR-338-3p-Ctrl组SIRT2表达与miR-338-3p组无明显差异(P>0.05),而共转染pcDNA 3.1-SIRT2的miR-338-3p+SIRT2组SIRT2蛋白表达较miR-338-3p-Ctrl组明显升高(P<0.05),而miR-338-3p+SIRT2组SIRT2蛋白表达较miR-con组无明显差异(P>0.05);2、miR-338-3p组胃癌细胞增殖能力较miR-con组明显降低(P<0.05)。miR-338-3p+SIRT2组胃癌细胞增殖能力则有一定程度的恢复(P<0.05);3、与miR-con组相比miR-338-3p组、miR-338-3p+SIRT2组和miR-338-3p+Ctrl组明显促进细胞的凋亡(P<0.05);miR-338-3p+Ctrl组与miR-338-3p组细胞的凋亡无明显差异(P>0.05);miR-338-3p+SIRT2组与miR-338-3p组细胞的凋亡能力明显降低,有差异(P<0.05);4、miR-338-3p组胃癌细胞迁移、侵袭能力较miR-con组明显降低(P<0.05),miR-338-3p+SIRT2组胃癌细胞迁移、侵袭能力则有一定程度的恢复(P<0.05);5、si-SIRT2组Wnt、β-catenin蛋白表达较si-con组明显降低(P<0.05)。结论:SIRT2上调可部分逆转miR-338-3下调引起的胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭抑制,Wnt/β-catenin信号通路是miR-338-3p/SIRT2调控胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭抑制的下游信号通路之一。