论文部分内容阅读
本课题将黄芪、板蓝根、淫羊藿按一定比例组成蓝芪复方,通过提取分离其多糖组分,进一步制备成蓝芪免疫增强注射剂,用于猪繁殖与呼吸综合征(又称蓝耳病,PRRS)的防治。本文对复方蓝芪多糖的提取、分离、纯化及免疫药效进行研究,为蓝芪免疫增强注射剂的开发和研制提供前期基础。主要研究内容如下:1、采用水提醇沉法提取复方蓝芪多糖,通过单因素试验和正交设计优化多糖提取工艺,复方蓝芪多糖的最佳提取工艺为:蓝芪复方药材脱脂后,以料液比为1:15,90℃浸提3次,每次2 h,合并提取液,浓缩至0.2 g生药/m L,离心,上清液加入3倍体积乙醇,醇沉12 h,蓝芪粗多糖提取率为2.24%。2、比较了双氧水法、树脂法和活性炭法对蓝芪多糖的纯化效果,并选用活性炭法进行工艺优化。对影响活性炭脱色脱蛋白的影响因素,如活性炭用量、多糖溶液pH、脱色时间、温度、脱色次数等进行考察,并利用正交设计对纯化工艺进行优化。活性炭的纯化工艺为:蓝芪粗多糖溶液浓度为2~3 mg·mL-1,加入2%(W/V)活性炭粉末,于60℃水浴振荡30 min,重复脱色3次,多糖保留率为77.4%,蛋白脱除率为89.6%,脱色率为86.2%。脱色脱蛋白的蓝芪多糖溶液经过反复冻融去除淀粉,透析去除小分子杂质,冻干,得到蓝芪纯化多糖。经冻干得到的产品为类白色,以葡萄糖折算,多糖含量由26.8%提高到46.7%。3、采用DEAE Sephadex A-50阴离子交换柱层析对蓝芪纯化多糖进行分级分离,得到LQ-1、LQ-2、LQ-3三个组分,其中LQ-2和LQ-3占总多糖的4.4%和68.5%,而LQ-1含量较少。LQ-2和LQ-3经Sephadex G100凝胶柱层析进一步分离均得到单一洗脱峰。经紫外鉴定,LQ-2和LQ-3不含蛋白质和和核酸等杂质。将LQ-2和LQ-3经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)进行纯化和测定分子量,LQ-2经鉴定为非均一多糖;LQ-3经HPGPC分离得到单一尖锐峰,为均一多糖,其数均分子量为6.34×105。测定粗多糖和纯化多糖的多糖分子量分布,结果表明经纯化后的多糖分子量分布与粗多糖的一致,说明所用的纯化方法不会改变多糖的分子量分布。4、通过碳粒廓清实验和二硝基氟苯诱导的迟发型超敏反应,研究蓝芪总多糖对正常小鼠非特异性免疫和细胞免疫功能的影响。结果表明:复方蓝芪总多糖可显著提高正常小鼠的脾脏指数,但对胸腺指数无明显影响;复方蓝芪总多糖可提高正常小鼠单核-巨噬细胞的吞噬能力和迟发型超敏反应的水平。