LukS-PV对人髓细胞白血病HL-60的细胞周期阻滞及凋亡的影响

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目的:PV-杀白细胞毒素(PVL, Panton-Valetine leukocidin)是金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,金葡菌)分泌的一种双组分白细胞毒素,可以特异性杀伤人和兔PMNs (polymorphonuclear leukocytes)导致PVL相关肺损伤的发生。LukS-PV是PVL的双组份之一,本课题前期研究发现重组LukS-PV蛋白(rLukS-PV)具有抑制急性髓细胞白血病(AML)细胞株HL-60增殖的作用,但其机制尚不清楚。本课题在体外表达并纯化获得rLukS-PV,研究rLukS-PV对HL-60的细胞凋亡和细胞周期的影响,并探讨其凋亡机制。方法:(1)体外培养HL-60细胞,分别加入0.05,0.25,0.50,0.75,1.00μmol/L rLukS-PV蛋白,共同孵育3,6,9,12h, MTS法检测rLukS-PV对HL-60细胞增殖抑制率。(2)体外培养HL-60细胞,分别加入0.05,0.50,1.00μmol/L rLukS-PV作用HL-60细胞12h,台盼兰染色观察细胞活力;流式细胞术和TUNEL检测HL-60细胞凋亡率、坏死率;流式细胞术检测细胞周期各时期分布;Western blot检测细胞周期调控蛋白cyclin A和cyclin D1表达。(3)体外培养HL-60细胞,加入1.00μmol/L rLukS-PV蛋白,共同孵育12h,Western blot检测细胞凋亡通路有关蛋白的表达,包括TNF、FAS、caspase-9、caspase-3、caspase-8、Bax和Bcl-2。结果:(1)随着rLukS-PV对HL-60细胞作用浓度的增加,台盼兰染色着色细胞逐渐增多,细胞活力进行性下降。(2)rLukS-PV处理组中HL-60细胞的增殖抑制率明显增高,且增殖抑制作用呈时间及剂量依赖性关系。(3)rLukS-PV促进HL-60细胞的凋亡,且凋亡作用呈剂量依赖性关系。(4)rLukS-PV处理组将HL-60细胞阻滞在S期,且细胞周期调控蛋白cyclin A呈剂量和时间依赖性降低,cyclin D1无明显变化。(5) Western blotting结果显示rLukS-PV作用HL-60细胞,caspase-8、 caspase-9、caspase-3、Bax表达升高,Bcl-2表达降低;而TNF和FAS不表达。结论:(1)rLukS-PV对HL-60细胞具有明显的抑制生长增殖作用,这种抑制生长增殖作用呈时间和剂量依赖性关系。(2)随着rLukS-PV浓度的增加,细胞的活力明显减低。(3)rLukS-PV可诱导HL-60细胞凋亡,且凋亡率呈剂量依赖性上升;可将HL-60细胞阻滞在S期,且细胞周期调控蛋白cyclinA表达呈剂量和时间依赖性下降。(4)rLukS-PV能促进HL-60细胞的凋亡通路中caspase-9、caspase-3、Bax的表达,同时,可下调Bcl-2的表达,提示rLukS-PV可通过线粒体凋亡的信号传导通路促进HL-60细胞的凋亡。
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