基于核酸适体传感器的赭曲霉毒素A检测方法研究

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在农作物的生长、收获、储存和运输过程中,很容易受到真菌毒素的污染。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是毒性强的真菌毒素之一,由于其对人体有致畸、致癌作用而受到特别的关注。常规的仪器分析法如高效液相色谱法因灵敏度高、结果准确可靠而受到检测机构的青睐,但样品前处理过程复杂,仪器昂贵,无法满足批量样品的现场快速检测,难以在基层实验室推广使用;基于抗原-抗体结合的酶联免疫分析方法具有简单、快速、易于推广等优点,然而,抗体制备过程复杂耗时、成本高,且抗体本身具有不稳定性,受免疫源性和假阳性等限制,不能作为最终的确证方法,妨碍了其更广泛的应用。本文利用核酸适体亲和力强、稳定性高、可进行官能团修饰等优势,结合电化学方法具有响应快、操作简单、仪器易于微型化等优点,利用碳基材料比表面积大、导电性好等特性,构建了基于炭气凝胶和羧基化多孔碳-纳米金的核酸适体电化学传感器用于快速检测粮食作物中OTA。具体的研究内容如下:1、将核酸适体作为识别元件固定在金电极(AuE)表面,利用炭气凝胶生物相容性好、比表面积大、导电性强等特性固载互补DNA(cDNA),并通过与核酸适体杂交连接到电极上,制备炭气凝胶-cDNA/适体/AuE电流型传感器,以亚甲基蓝(MB)为电化学信号探针,进行OTA的检测研究。研究发现,MB在炭气凝胶-cDNA/适体/AuE传感器上的电流值比在cDNA/适体/AuE传感器上增大100.4%,说明炭气凝胶具有良好的信号放大作用。对实验参数进行优化,得到最佳实验条件:核酸适体最佳浓度为4μmol/L,核酸适体和cDNA杂交时间为2h,MB的最佳固定方式为浸泡15min,OTA的最佳孵育时间为18min。在最优条件下,利用构建的传感器对OTA进行检测,当OTA浓度在0.01-20ng/mL时具有良好的线性关系,检出限是1.0×10-4ng/mL,相关系数是0.996。利用加标回收法对玉米样品进行检测,测得平均回收率为89.3%。2、前期实验发现,在AuE上固定核酸适体可能会影响其与OTA结合时的构象变化,因此本实验改变方案,采用在AuE上固定cDNA,同时利用多孔碳具有开放的孔隙结构、比表面积大、导电性强等优点,结合纳米导电性好及生物亲和能力强等特性,制备羧基化多孔碳-纳米金复合材料修饰AuE,用于提高cDNA的固载量并实现信号放大,通过杂交连接核酸适体,构建适体/cDNA/羧基化多孔碳-纳米金/AuE电流型传感器。MB在适体/cDNA/羧基化多孔碳-纳米金/AuE上的电流值比在适体/cDNA/AuE电流值增大了175.6%,说明羧基化多孔碳-纳米金具有良好的信号放大作用。利用该传感器对OTA进行检测,当OTA浓度为5.0×10-6-5.0×10-4ng/mL时具有良好的线性关系,相关系数是0.997,检出限是5.0×10-6ng/mL。对玉米样品进行检测,平均回收率为103%。对传感器进行性能研究,实验结果表明该传感器具有良好的重复性、稳定性和特异性。
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