骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是一种源于间叶组织的恶性肿瘤,以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征,好发于儿童及青少年。化疗出现以前,骨肉瘤的主要治疗是高位截肢或局部广泛切除和放疗,80%的患者死与肺转移,2年生存率仅为15%-20%,且局部复发率很高。随着术前化疗(新辅助化疗)概念的提出,骨肉瘤患者的预后有了很大的提高,5年生存率由15%提高到了70%以上,且实施了保肢手术,但在临床治疗中,由于远处转移和化疗药物耐药性的产生是导致治疗失败的重要原因。继续增大传统化疗药物的剂量可以引起不可逆性肾功能损害、心脏毒性及严重的胃肠道反应等毒副作用,限制了其临床应用及疗效的进一步提高。因此,探索新的、有效的化疗药物将有助于骨肉瘤患者的治疗。 细胞凋亡,又称为程序性细胞死亡,是一种由多种基因参与并由不同信号传导途经介导的程序化的主动死亡过程,具有特定的形态学特征和生化特征,与肿瘤的发生、浙江大学硕士学位论文发展和治疗密切相关。临床上应用的化疗、放疗等方法治疗肿瘤的作用机理就是诱发肿瘤细胞凋亡,诱导细胞凋亡的能力已经成为筛选抗癌药物和识附古药物疗效的有用指标。如何进一步提翩中瘤细胞的凋亡率、避免化疗耐药性的产生、同时保护正常细胞免于细胞毒副反应,已成为目前肿瘤治疗研究领域中的热点问题。 泛秦蛋白酶体通路(ubiq林itin-proteasome详山W盯)是细胞内决速降解并处理蛋白的一种非溶酶体工具,在细胞蛋白的时序性降解中处于核心地位。它主要降解大量半衰期较短的调节因子,包括各种细胞周期调节子和肿瘤抑制基因及一些转录因子,如P53、cyclins、核因子次B八虑、c一Myc、c一un等。特异性阻断泛素蛋白酶体通路可阻断细胞内蛋白质的时序性降解,干扰细胞的正常生理功能,并诱导细胞发生凋亡,且对正常细胞伤害不大。阻断泛素一蛋白酶体通路因其育目寺异性的杀歹朋中瘤细胞而成为目前肿瘤治疗中受人瞩目的新的作用靶向。 我们以体外培养的人成骨肉瘤MG63细胞为研究对象,通过蛋白酶体抑制剂Z一LLL一CHO特异性地阻断细胞内蛋白降解的泛素蛋白酶体通路,观察体外对人成骨肉瘤MG一63细胞生长的影响和诱导凋亡作用,并探讨其作用机制。为临床治疗骨肉瘤提供积极的参考价值。浙江大学硕士学位论文第一部舍,阻断注素一蛋白峰体通路对人考肉瘤佃胞株 MG一63位长的影响 目的:观察阻断泛素一蛋白酶体通路对人骨肉瘤细胞株MG一63生长的影响,并初步探讨其作用机制。 方法:将不同浓度的蛋白酶体抑制剂Z一LLL一CHO分别作用于人骨肉瘤细胞株MG一63和人胚肺二倍体成纤维细胞株wi一38,采用用四甲基偶氮哇蓝伽耳)快速比色法检测细胞增殖活力、倒置相差显微镜观察细胞形态改变、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段、流式细胞仪分析细胞凋亡率。实验数据均表示为均数士标准差,差异显著性检验采用StLldent冬t检验,加权直线回归法计算IC50,应用SPSS 10.0统计软件进行数据分析。 结果:本研究发现阻断泛素一蛋白酶体通路对人骨肉瘤MG一63细胞株有选择性的生长抑制作用,并诱导细胞发生凋亡。浓度为0.1、1 .0、10.0四。比的蛋白酶体抑制剂Z一LLL一CHO作用72h后MG一63细胞存活率降至87.4%、343%、1 .7%,呈现浓度依赖性;Z一LLL一CHO浓度为1 .0四10比时,作用24、48、72h后MG一63细胞存活率分别降至792%、43.5%和34.3%,呈现时间依赖性。阻断泛素一蛋白酶体通路对人骨肉瘤MG一63细胞的生长抑制作用较人用明市二倍体成纤维细胞wi一38敏感近10倍,其72h的ICso分别为(0 .92士0.06)卿。比和(9 .13士0.12)脚的。比。浓度为1.0脚的o比的Z一LLL一CHO作用24h后,琼脂糖凝胶电泳MG一63细胞的DNA呈“阶梯状”排列条带,而wi一38细胞的DNA则为基因组DNA。流式细胞仪分析进一步显示,浓度为1.0脚肌o比的Z-LLL一CHO作用24h后,MG-63和v压38细胞的凋亡率分别为5.4%和0.9%,说明阻断泛素一蛋白酶体通路可特异性的诱导骨肉瘤MG一63细胞凋亡,具有一浙江大学硕士学位论文定的选择性。结论:阻断泛素蛋白酶体通路对体外培养的骨肉瘤MG石3细胞有明显的生长抑制作 用,并且具有选择性,表明泛素一蛋白酶体通路可作为骨肉瘤治疗的一个潜在 靶点。第二部令,阻断该素一蛋白峰体通路枪导人于肉瘤佃胞株 MG一63城亡的实脸研究 目的:探讨阻断泛素蛋白酶体通路对人骨肉瘤MG一63细胞生长抑制和诱导凋亡作用,并研究分析其作用机制。 方法:将不同浓度的Z一LL一CHO作用于骨肉瘤细胞株MG一63,应用四甲基偶氮哇蓝洲丁D快速比色法检测细胞增殖活力、倒置相差显微镜观察细胞形态改变、Hoechest 33258荧光染色观察细胞核形态改变、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡、流式细胞仪分析细胞凋亡率和细胞周期的变化、透射电镜观察细胞超微结构改变、蛋白免疫印迹检测caspase一3蛋白含量。实验数据均表示为均数士标准差,差异显著性检验采用Student、一t检验,应用Windows SPSS 10.0统计软件进行数据分析。 结果:阻断泛素一蛋白酶体通路对体外培养的人成骨肉瘤MG一63细胞具有明显的生长抑制作用,并诱导细胞发生凋亡。凋亡细胞表现为浓染致密的颗粒块状荧光,DNA呈“阶梯