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研究背景：喉癌是上呼吸道最常见的恶性肿瘤,占头颈部肿瘤的25%左右。传统的喉癌治疗手段为根治性手术或放射治疗,辅以或不辅以化学治疗,但是传统治疗手段导致的喉功能部分甚至全部丧失或严重的副反应极大地影响了患者的生存质量,且仍有部分患者出现治疗后复发。尽管手术术式、放疗方法及化疗方案在革新中不断进步,近30年来患者的生存率并无明显改善。而失去根治性治疗机会的晚期患者多行姑息性化疗,长期以来该期患者的5年生存率始终停留在30%左右。近20年来,分子靶向治疗作为一种新型的治疗手段在肿瘤的治疗中取得了重大突破。对于头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC),最具代表性的分子靶向药物为特异性抑制表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)的单克隆抗体及小分子酪氨酸激酶抑制剂。然而以吉非替尼为代表的小分子抑制剂对HNSCC并无明确疗效,而以西妥西单抗为代表的单克隆抗体虽然对传统的放、化疗起到一定的辅助作用,然而由于有限的反应率,较高的耐药率及频发的皮肤毒性、消化道症状等副作用使得该类药物的应用空间仍然不大。随着分子克隆技术的进步,以病毒为表达载体,通过RNA干扰技术特异性下调EGFR表达的基因治疗策略为肿瘤的治疗开辟了新的方向。而随着RNA干扰技术的不断改进,目前已出现人工microRNA (artificial microRNA, amiR),即第二代shRNA,与siRNA及第一代shRNA相比,人工microRNA在保留第一代shRNA发夹结构的基础上,加入了天然microRNA的框架,除了更高效之外,最大的优势在于可以被哺乳动物体内大多数的启动子所启动。而人工microRNA的这一优势使得采用肿瘤组织特异性启动子来调控靶向EGFR的RNA干扰成为可能。基于以上研究背景,我们拟设计以EGFR为靶点的人工microRNA,并利用重组腺病毒为载体,通过喉癌特异性的SLPI启动子调控该人工microRNA的表达,并以Hep-2为研究对象,探讨该基因治疗策略抑制肿瘤生长的作用。研究目的：构建荷载有在SLPI启动子调控下的靶向EGFR的人工microRNA的重组腺病毒载体,并研究其安全性及对喉癌细胞的体内外抑制作用。研究方法：1、构建腺病毒穿梭质粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA, Ad-SLPI-GFP-pA,分别与骨架质粒pBGHlox (delta) E1,3Cre共转染HEK293细胞进行腺病毒包装。以PCR, western blot等方法鉴定重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP。扩增病毒,并以CsCl密度梯度离心法纯化扩增的腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。2、将重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及对照病毒Ad-SLPI-GFP分别感染人喉鳞状上皮癌细胞株Hep-2和人正常脐静脉内皮细胞株HuVEC,通过显微镜观察,MTT,流式细胞仪细胞凋亡分析检测病毒对喉癌细胞Hep-2及正常细胞HuVEC增殖的影响。3、建立裸鼠喉癌荷瘤模型,予瘤内注射重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR、 Ad-SLPI-GFP,或每日口服吉非替尼。比较治疗过程中各组瘤体体积变化及观察期结束后的瘤体重量。观察治疗过程中裸鼠的饮食、活动及精神状态,并比较裸鼠体重的变化情况。研究结果：1重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP的包装,鉴定、扩增、纯化及滴度测定腺病毒穿梭质粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA、pDC312-SLPI-GFP-pA分别与骨架质粒pBGHlox (delta) E1,3Cre共转染HEK293细胞,转染第13天左右,倒置显微镜下观察,发现80%以上的细胞都发生细胞病变效应,呈葡萄状,贴壁不牢易脱落。收集感染细胞,反复冻融,病毒上清经蛋白酶K处理后,PCR检测示Ad-SLPI-EGFRamiR扩增出不同重复序列数的EGFRamiR片段,142bp、284bp、426bp片段,Ad-SLPI-GFP扩增出1482bp片段,示重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及对照病毒Ad-SLPI-GFP构建成功。予扩增纯化后进行滴度测定。Ad-SLPI-EGFRamiR滴度为1×1010pfu/ml, Ad-SLPI-GFP滴度为6.3×109pfu/ml。Western blot结果显示,Ad-SLPI-EGFRamiR病毒作用72小时的Hep-2细胞,170kdEGFR表达显著降低。而Ad-SLPI-GFP感染72小时后,荧光显微镜下可见大量Hep-2细胞呈现较强的绿色荧光信号,而HuVEC细胞仍无绿色荧光。以上结果表明,SLPI启动子能够在喉癌细胞内有效下调EGFR,并特异性调控绿荧光蛋白在人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞中表达,而在正常人脐静脉内皮细胞HuVEC中无表达,72小时为合适的感染时间。2重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR对喉癌细胞Hep-2的体外抑制作用2.1重组腺病毒对细胞增殖抑制作用的试验MTT结果显示,感染72小时后重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR对喉癌细胞Hep-2的增殖有较强的抑制作用,在MOI为50pfu/cell时就能有效地抑制喉癌细胞的增殖(抑制率为22.5%),但对正常细胞HuVEC的增殖却无明显抑制作用(抑制率为-4.2%)。2.2重组腺病毒作用72小时后细胞形态学变化重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR (MOI=50)作用72小时后的喉癌细胞Hep-2在形态学上发生了显著的变化：细胞变圆,皱缩,部分呈串珠状、浮起。而正常细胞HuVEC在病毒作用前后细胞形态差异不明显。而对照病毒Ad-SLPI-GFP (MOI=50)作用前后,Hep-2及HuVEC细胞形态均无明显差异。2.3流式细胞仪定量分析细胞凋亡流式细胞仪检测显示重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR在MOI=35及MOI=50下作用72小时后,Hep-2细胞的凋亡率(层Annexin V-R-PE和7-AAD均染色的细胞)分别为32.8%和31.8%,而Ad-SLPI-GFP作用72小时后相应的凋亡率分别为9.2%和10.0%,两种病毒差异显著,从定量角度说明重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR能通过有效诱导凋亡而对喉癌细胞的生长增殖起抑制作用。而对于正常脐静脉内皮细胞HuVEC,在MOI=35的Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP作用72小时后的凋亡率分别为11.1%,8.2%,在MOI=50的相应病毒作用下凋亡率分别为15.5%,4.8%,差异均不显著。3重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR对喉癌荷瘤模型肿瘤组织生长的抑制作用3.1重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的体内抑制肿瘤生长作用在首次治疗后第13天,Ad-SLPI-EGFRamiR治疗组的瘤体体积小于Ad-SLPI-GFP组及吉非替尼组,但是这一差别无统计学上的显著意义(P>0.05)。与首次治疗日的瘤体体积相比,Ad-SLPI-EGFRamiR组的瘤体体积增长速度小于Ad-SLPI-GFP组及吉非替尼组,但是仍无统计学上的显著意义(P>0.05)。在观察结束时(首次给药后第20天)Ad-SLPI-EGFRamiR组瘤重小于Ad-SLPI-GFP组及吉非替尼组,但这一差别无统计学上的显著意义(P>0.05)。3.2重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的体内不良反应观察在治疗过程中,Ad-SLPI-EGFRamiR组及Ad-SLPI-GFP组裸鼠的身体状况良好,精神状态、活动及饮食情况均无明显异常。但是吉非替尼组的部分小鼠出现精神萎靡、腹泻、食欲不振情况。Ad-SLPI-EGFRamiR组裸鼠的体重增长率与Ad-SLPI-GFP组裸鼠相比无明显差异(P>0.05),但是却明显高于吉非替尼组(P<0.05)。研究结论：1、重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR和Ad-SLPI-GFP均能有效感染Hep-2细胞,并表达相应的基因,具有良好的喉癌组织特异性。2、重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR在体外能显著地特异性抑制喉癌细胞的生长,而对正常细胞抑制作用较低。3、在荷瘤裸鼠模型中,重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR有抑制肿瘤组织生长的趋势。4、在荷瘤裸鼠模型中,重组腺病毒与吉非替尼相比具有较高的安全性。