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肌肉生长抑制素(myostatin,也称GDF-8)基因是骨骼肌生长发育的负调控因子。著名的具有“双肌”表型的比利时蓝牛与皮尔蒙特牛就是由于myostatin基因缺失或突变引起的。由于“双肌”动物具有产肉率与瘦肉率高、生长速度快、节省饲料等优点,能给肉用畜禽饲养业带来更大的经济效益。为了改良我国著名肉役兼用品种秦川牛的产肉性能,本研究利用测序的方法详细比对了秦川牛与肉用品种红安格斯牛的myostatin基因的核苷酸组成及多态性,探寻引起肌肉发育差异的原因;并在此基础上研究了myostatin基因第一内含子与启动子对基因表达的影响;同时,分离培养了秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞,并对其进行纯化、鉴定;通过基因打靶的方法,将秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞与成纤维细胞myostatin基因外显子III的部分核苷酸缺失,抑制该基因的生物学功能;将筛选到的阳性成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植,观察核移植胚胎的发育情况,并对其进行鉴定。1、通过PCR扩增及正反重复测序的方法分析了16头秦川牛与4头肉用品种红安格斯牛的myostatin基因的核苷酸多态性,并与GenBank上已发表其它品种牛myostatin基因序列进行比对分析,结果发现,在2个不同品种牛之间myostatin基因高度保守,同源性在95 %以上;在3个外显子上均发现1-4个核苷酸多态性,其中只有外显子I上3个突变引起编码的氨基酸改变,其它都为同义突变;在16头秦川牛中有3头秦川牛第一内含子705个核苷酸后发现有连续16 bp碱基的插入突变。2、用PCR的方法分别克隆秦川牛和红安格斯牛myostatin基因的启动子和第一内含子,并进行序列分析;以EGFP为报告基因构建真核表达载体pEGFP-MSTNPro- intron 1和pEGFP-MSTNPro转染C2C12细胞,48 h后,利用流式细胞仪测定转染细胞的平均荧光强度与阳性细胞率,研究牛myostatin基因启动子和第一内含子对基因表达的影响。结果发现,两种牛myostatin基因的启动子序列同源性99 %,第一内含子的同源性为99.51 %,秦川牛、红安格斯牛第一内含子与已发表序列(GenBank No.AF320998)同源性分别为99.08 %与99.02 %,而其中有3头秦川牛的第一内含子在第705位比其它秦川牛以及红安格斯牛多16个碱基,经流式细胞仪测定发现两种牛myostatin基因启动子对EGFP基因在C2C12细胞中表达的影响差异不显著(P>0.05);与第一内含子正常组相比第一内含子的突变(即插入16个碱基)对EGFP报告基因在C2C12细胞中表达的影响不显著(P>0.05),而与不含内含子组相比较第一内含子的存在可以显著增强EGFP报告基因在C2C12细胞中的表达(P<0.05或P<0.01)。3、对经Ⅰ型胶原酶消化法、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶联合的二步消化法和链霉蛋白酶消化法得到的秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞进行原代和传代培养,用差速贴壁与Percoll密度梯度离心相结合的方法进行肌卫星细胞纯化,利用myostatin基因的RT-PCR以及Desmin免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定,结果显示这3种分离方法都可以得到骨骼肌卫星细胞,但细胞数及细胞存活率不同,细胞数(×106)分别为0.0017±0.00023,0.5430±0.1357和8.1800±0.7950,细胞存活率(%)分别为92.67±3.79,89.33±2.52和62.67±3.06。4、通过PCR的方法克隆秦川牛myostatin基因的部分片段作为基因打靶的同源臂(长臂和短臂),在同源短臂上缺失外显子III的部分核苷酸(缺失部分包括比利时蓝牛缺失的11 bp核苷酸),分别克隆入本实验室已经构建好的通用型基因打靶载体PA2T的2个多克隆位点,构建了缺失myostatin基因外显子III部分碱基的秦川牛myostatin基因打靶载体,通过电转染的方法转染秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞与成纤维细胞,经正负药物筛选,提取阳性克隆细胞的基因组进行PCR、Southern blot鉴定,分别确定了2个细胞克隆的myostatin基因的一条等位基因被成功缺失,2个阳性骨骼肌卫星细胞经myostatin(GDF-8)抗体Western Blot分析,结果证实经基因打靶缺失部分核苷酸后myostatin蛋白表达显著降低。5、通过流式细胞仪分析2株阳性成纤维细胞的细胞周期,发现2株阳性克隆细胞增殖指数PrI值(S+G2M)%分别为23.12%、20.96%,低于对照成纤维细胞29.8%;以这2株阳性成纤维细胞为供体细胞,经体细胞核移植后发现,它们都可以支持克隆胚体外发育到囊胚,卵裂率分别为61.17%和66.36%,囊胚发育率为18.45%和21.82%,但囊胚发育率明显低于非转基因成纤维对照组(P<0.05);而且阳性细胞作为供核细胞获得克隆胚囊胚内细胞的凋亡率显著高于正常对照成纤维细胞为供核细胞获得克隆胚囊胚细胞的凋亡率(11.66±1.84 vs 8.32±1.60, P<0.05)。