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研究目的:细胞内基因表达与信号网络的调控失常经常诱发肿瘤的恶性表型,如无限增殖、凋亡抵抗、化疗耐药和转移复发等。在细胞内,存在数百种不同的翻译后修饰可以调控这些信号网络中关键蛋白的定位、稳定性、相互作用与转录,从而影响肿瘤进程。脂质翻译后修饰可以增强底物蛋白的脂溶性,使其对质膜、内质网和高尔基体有更好的亲和性。S型棕榈酰修饰催化棕榈酸连接到底物蛋白半胱氨酸残基上,并且这种结合具有可逆性。迄今为止,研究发现大量肿瘤关键调控蛋白存在S型棕榈酰修饰。因此,介导蛋白S型棕榈酰修饰的棕榈酰转移酶DHHC蛋白家族受到广泛关注。DHHC蛋白与肿瘤和神经系统疾病等多种疾病存在密切联系,提示我们DHHC蛋白具有重要生物学功能。许多研究发现DHHC蛋白的频繁缺失与异常扩增,在不同的肿瘤中发挥相反的作用。急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是一种血液系统肿瘤,在临床和生物学上具有异质性。近几年,AML治疗的相关研究从快速发展期逐渐进入瓶颈期。临床上AML的化疗药物主要为阿糖胞苷、蒽环类抗生素和全反式维甲酸类药物。标准化疗后患者长期无病生存率仅30～40%且预后差,经常存在化疗耐药和复发的情况。因此,需要寻找AML治疗的新型潜在靶标和干预手段。而有研究发现DHHC9可以影响N-Ras介导的T细胞急性淋巴细胞白血病以及DHHC14促进急性双表型白血病的发生发展,提示DHHC蛋白可能在白血病中有重要生物学功能。前期研究中,我们发现抑制DHHC活性可诱导AML细胞发生分化。因此,本研究将在此基础上进一步明确调控急性髓系白血病细胞分化的关键DHHC蛋白,并探讨其调控AML分化的内在机制,以期为临床AML治疗提供全新分子靶标和潜在干预策略。研究方法:选定HL60和NB4(AML细胞株)为研究对象。采用NBT还原实验和RG染色实验检测棕榈酰转移酶DHHC活性抑制剂2-Bromopalmitate(2BP)对AML细胞株的分化诱导作用;采用Oncomine数据库考察不同DHHCs在各种肿瘤中的表达情况;采用Oncomine数据库比较正常骨髓细胞和AML细胞的DHHC3和DHHC21的表达情况;采用Quantitative-Real-time PCR确证shDHHCs的沉默效率;采用流式细胞术检测沉默DHHCs对分化标记物CDllb表达的影响;采用NBT还原实验和RG染色实验检测沉默DHHCs对AML细胞的分化作用;采用细胞计数检测沉默DHHC21对细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术检测沉默DHHC21后分化标记物CDllb和CD14的时效变化;采用NBT还原实验和RG染色实验检测沉默DHHC21对AML细胞的分化作用:采用Quantitative-Real-time PCR检测沉默DHHC21对STAT1、PU.1及CEBPβ的mRNA水平影响;采用NBT还原实验检测不同的信号抑制剂R041-5253(RARα拮抗剂)、LY-294002(PI3K抑制剂)、PD-98059(MEK 抑制剂)、SB-203580(P38 抑制剂)与 SP-600125(JNK 抑制剂)对 shDHHC21诱导分化的影响;采用基因芯片建立沉默DHHC21的基因表达谱;采用Metabase对差异基因进行功能聚类分析;采用Quantitative-Real-time PCR确证沉默DHHC21后差异基因的变化;采用NBT还原实验检测沉默MAFB、IRF9或PLSCR1对shDHHC21诱导分化的影响。研究结果:①抑制不同DHHC蛋白对AML细胞分化的影响:不同浓度的棕榈酰转移酶活性抑制剂2BP作用后,AML细胞的NBT还原能力增强以及细胞核形态向分化转变;以数据库比较白血病中DHHCs的表达,发现DHHC3与DHHC21的表达最高,DHHC8、DHHC9、DHHC14次之,而其他DHHC表达相对较低;分析数据库发现DHHC21在AML细胞中的表达比正常骨髓细胞高,且具有显著性差异,而DHHC3在两种细胞间表达没有差异;沉默DHHC3、DHHC7、DHHC21或DHHC23后,唯有沉默DHHC21可以特异地提高CDllb的阳性比例、促进NBT还原能力以及介导细胞核形态变化。②确证shDHHC21可诱导AML细胞分化:沉默DHHC21可以提高AML细胞分化标记物CDllb和CD14的表达,且具有一定的时效关系;沉默DHHC21可以增强AML细胞对NBT的还原能力,并促使细胞核质比明显下降、核形态向分化形态转变;沉默DHHC21可以提高STAT1、PU.1及CEBPββ的mRNA水平。③经典分化信号在shDHHC21诱导AML细胞分化中的作用:以LY-294002抑制PI3K活性、PD-98059抑制MEK活性或SP-600125抑制JNK活性可以逆转shDHHC21诱导的AML细胞分化;而以SB-203580抑制P38活性不能逆转shDHHC21诱导的AML细胞分化;以R041-5253抑制RARα活性不能逆转shDHHC21诱导的AML细胞分化。④探索shDHHC21调控AML细胞分化的分子机制:采用基因芯片成功建立沉默DHHC21后AML细胞内的基因表达谱,发现在第1、2和3天多个基因呈现出显著变化(分别有570、137和169个基因上调,118、44和50个基因下调),而其中同时上调的基因有3 1个,共同下调的基因有5个;Quantitative-Real-time PCR结果显示,沉默DHHC21后,差异基因(AGPAT9、CLEC7A、MAFB、PARP9、IFIT2、IRF9、IFIT5、FPR1、IF16、PLSCRl)的 mRNA 水平的确显著上调;shMAFB、shIRF9或shPLSCRl对沉默DHHC21诱导的AML细胞分化没有明显影响。研究结论:本研究发现通过棕榈酰转移酶活性抑制剂2BP可以诱导AML细胞发生分化。在寻找此效应的关键DHHCs时,发现相较于其他DHHC亚型蛋白,沉默DHHC21可以特异地诱导AML细胞分化,较好地解释了 DHHC21在临床AML患者中异常表达的情况。且我们明确了沉默DHHC21诱导AML细胞的分化方向——单核/巨噬分化,并且依赖其棕榈酰转移酶活性。而进一步深入研究发现,shDHHC21通过调控分化相关转录因子以及PI3K、MEK、JNK等单核/巨噬细胞分化相关信号网络进而诱导AML细胞分化。此外我们还发现shDHHC21诱导的AML分化不依赖与维甲酸受体RARα。本研究不仅发现DHHC21调控AML细胞分化的新生物学功能及其机制,而且为AML的临床治疗提供了潜在的分化新靶标。