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目的:探讨栀子苷对巨噬细胞RAW264.7内吞功能的影响及其相关机制,观察栀子苷对RAW264.7细胞表型极化的影响作用。方法:1.巨噬细胞内吞功能实验:运用CCK-8法观察不同浓度、时间点栀子苷对RAW264.7细胞增殖的影响;根据CCK-8法的测定结果,确定栀子苷试验浓度及共培养时间(设空白对照组和不同浓度栀子苷实验组),用中性红染料法检测细胞胞饮活性;根据胞饮试验结果确定噬菌试验的栀子苷浓度,荧光显微镜下观察RAW264.7细胞吞噬染色的铜绿假单胞菌,并进行细菌胞内存活试验,对不同时间点RAW264.7细胞释放的胞内细菌进行计数比较。2.影响巨噬细胞内吞功能的信号机制实验:分别设空白对照组、栀子苷实验组(RAW264.7巨噬细胞与2.0mg/m L栀子苷共培养24 h)、LPS炎症模型组(RAW264.7巨噬细胞与100ng/m LLPS共培养4 h)、栀子苷治疗组(在LPS炎症模型组上加入2.0mg/m L栀子苷共培24 h)和栀子苷预防组(在栀子苷实验组基础上加入100ng/m L LPS共培4 h),采用RT-PCR法检测各组细胞m Tor-Rho GTPases信号通路相关基因(Cdc42、Rho A、Rac1)m RNA表达的变化,Western Blot法检测相关蛋白(m Tor、Rho A、Rac1、Cdc42)及其磷酸化的表达水平。3.RAW264.7细胞表型极化观察实验:分别设空白对照组、栀子苷实验组、LPS炎症模型组、栀子苷治疗组和栀子苷预防组,运用流式细胞技术检测各组细胞极化标志物i NOS~+和CD206~+的表达,根据这两种标志物水平的变化来判定RAW264.7细胞表型的变化;运用ELISA法检测各组细胞上清液中的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1和抗炎症细胞因子IL-10水平,进一步验证RAW264.7细胞表型的改变。结果:1.CCK-8实验结果显示,栀子苷在2.0～8.0 mg/m L浓度范围内,各剂量组栀子苷作用48 h后均对RAW264.7细胞体外生长没有明显抑制作用。RAW264.7细胞与2.0 mg/m L栀子苷共孵育24 h后,与空白对照组相比,显著增加了RAW264.7细胞对中性红的吞饮效能(P<0.01)。2.荧光显微镜观察RAW264.7细胞吞噬染色的铜绿假单胞菌,空白对照组可见RAW264.7细胞吞噬了大量铜绿假单胞菌,胞内铜绿假单胞菌基本无法分清;而栀子苷组RAW264.7细胞胞内可见少量被吞噬的铜绿假单胞菌。细菌胞内存活实验结果显示,栀子苷组仅在0 h与2 h存在差异性变化(P<0.01),与空白对照组相比,栀子苷组RAW264.7细胞0 h对铜绿假单胞菌的吞噬数量少(P<0.05),2 h胞内存活细菌明显增多(P<0.01)。3.RT-PCR检测结果显示,空白对照组和栀子苷实验组之间m TOR、Cdc42、Rac1、Rho A m RNA的表达均无差异(P>0.05);LPS作用后,RAW264.7细胞内四组基因表达均显著增加(P<0.01);栀子苷治疗给药和预防给药后,上述四基因表达均显著下降(P<0.01),其中预防给药组下降得更明显(P<0.01)。Western Blot法结果分析显示,m Tor、Cdc42、Rac1、Rho A蛋白表达分别在五组细胞中均无明显变化(P>0.05);其磷酸化水平p-m Tor、p-Cdc42/Rac1、p-Rho A在空白对照组和栀子苷实验组中表达也无显著差异(P>0.05);LPS炎症模型组中,磷酸化的各种蛋白表达显著增多(P<0.01);栀子苷治疗给药组和预防给药组均能抑制LPS引起的上述磷酸化蛋白的升高(P<0.01),其中预防组比治疗组抑制得更明显(P<0.01)。4.流式细胞技术检测结果显示,LPS炎症模型组中的M1细胞比率较空白对照组明显增加(P<0.05),栀子苷治疗组和预防组相比LPS炎症模型组显著下降(P<0.05,P<0.01);LPS炎症模型组的M2比率较空白对照组和栀子苷明显减低(P<0.01),栀子苷治疗给药组和预防给药组的M2比率较空白对照组和栀子苷实验组显著升高(P<0.01),且栀子苷治疗组较预防组升高更明显(P<0.01)。ELISA法结果显示,空白对照组与栀子苷实验组之间TNF-α、IL-1、IL-10均无统计学差异(P>0.05);LPS炎症模型组中上述三种细胞因子均升高(P<0.01);与LPS炎症模型组相比,栀子苷治疗组TNF-α、IL-1明显下降(P值分别为<0.01,<0.05),栀子苷预防组TNF-α、IL-1较栀子苷治疗组下降更明显(P<0.01);与LPS模型组相比,栀子苷治疗组和预防组的IL-10均增加(P<0.01),且药物预防组增加更明显(P<0.01)。结论:1.栀子苷能够促进巨噬细胞RAW264.7对中性红的胞饮活性,能抑制对胞外铜绿假单胞菌的吞噬和胞内消化杀菌能力,其抑制巨噬细胞噬菌能力的机制可能与m Tor-Rho GTPase通路相关基因、蛋白表达下降有关;2.栀子苷能使LPS诱导的M1型RAW264.7巨噬细胞向M2表型偏移。