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乙烯(Ethylene)是一种植物激素,对植物生长发育和逆境胁迫具有重要的调控作用。在乙烯的生物合成途径中主要有腺苷甲硫氨酸合成酶(S-Adenosyl-L-Methionine Synthetase,SAMS)、1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase,ACS)和 1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase,ACO)等关键基因。研究发现ACS和ACO是参与植物体内乙烯生物合成途径中的关键酶。油菜是我国食用油的主要来源,但其伴生杂草如稗草的存在严重地影响了油菜的产量和品质。本研究以二氯喹啉酸抗性和敏感性稗草为研究材料,克隆得到ACS和ACO基因(EcACS-R和EcACS-S,EcACO-R和EcACO-S),并进行序列分析、定量分析、原核表达分析和酶活性测定等相关研究工作。主要研究成果如下:1)1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因(ACS):从稗草叶片中克隆得到ACS基因,其中,抗性植株中得到的基因为EcACS-R,敏感性植株中得到的基因为EcACS-S。①EcACS-R全长的核苷酸序列长度为1630 bp,其中编码区序列1452 bp,编码483个氨基酸,预测蛋白分子量大小为53 kD,理论等电点为53.59;EcACS-S全长的片段为1670bp,其中编码区序列1470bp,编码489个氛基酸,预测蛋白质相对分子量为54 kD,理论等电点为54.02。系统进化树分析后发现,ACS和单子叶植物小米(Setaria italica)、玉米(Zea mays)等的ACS基因具有较高的同源性。EcACS-R和EACS-S氨基酸序列比对分析发现存在4个多态性位点,即V230→G;D295→A;A370→V;K442→R,同时抗性材料在R442之后缺失4个氨基酸。②以β-Actin基因作为内参,对EcACS-R和EcACS-S进行荧光定量PCR(qPCR)分析,结果发现两个基因的相对表达水平发现无显著性差异。③利用带有MBP标签的原核表达载体pMAL-c5x,分别构建了表达载体MBP::EcACS,并转化至大肠杆菌BL21,经终浓度为0.4 mmol·L-1PTG诱导16 h后表达,经12%SDS-PAGE电泳分析结果表明融合蛋白表达条带大小和理论值相同。2)1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(ACO):从稗草叶片中克隆得到ACO基因,抗性植株中克隆得到的基因命名为EcACO-R,敏感性植株中克隆得到的基因命名为EcACO-S。①EcACO-R和EcACO-S基因的核苷酸序列长度均为1000 bp,其中编码区序列为936 bp,编码311个氛基酸,预测蛋白分子量大小为35 kD,理论等电点为5.4。系统进化树分析后发现,ACO和单子叶植物的小米(Setariaitalica)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghum bicolor)等的ACO基因同源性较高,表明EcACO基因在不同物种间是保守的。测序所得抗性和敏感性EcACO基因序列及对应氨基酸序列比对发现EcACO-R和EcACO-S的氨基酸序列存在5个突变位点,即F98→Y;G101→D;Q206→R;G270→V;A272→G。其中 F98→Y;G101→D;Q206→R 均处于预测蛋白保守结构域DIOX_N和20G-FeIⅡ_Oxy中,DIOX_N和20G-FeⅡ_Oxy均与植物体内的氧化还原反应有关。②以β-Actin基因作为内参,对EcACO-R和EcACO-S进行qPCR分析,分析两个基因的相对表达水平发现EcACO-R和和cACO-S的表达量无显著性差异。③成功构建了 MBP::EcACO的表达载体,经终浓度为0.4 mmol·L-1PTG诱导16 h后,经12%SDS-PAGE电泳分析结果表明融合蛋白表达条带大小和理论值相同。④离心收集诱导表达后的含MBP::EcACO的大肠杆菌BL21,采用MBP亲和层析柱纯化上清中的MBP::EcACO,测定纯化后的MBP::EcACO蛋白活性发现,MBP::EcACO-R的蛋白活性显著低于MBP::EcACO-S。