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转基因技术日益成为品种改良的重要手段,并为人类带来巨大经济效益,但是由于目前大多使用抗生素抗性基因和抗除草剂类基因作为标记基因,对环境和人类健康存在或潜藏着无法评估的不良影响和损害,从而限制了转基因作物在商业生产中的推广利用。目前解决这一问题最有效的方法就是利用无争议的生物安全标记基因。
本研究构建了以PMI为筛选基因,分别由35SP和PSP驱动密码子优化抗菌肽D基因的植物表达载体,以“红1—7”暗柳橙实生黄化苗上胚轴和“布鲁诺”猕猴桃实生无菌苗叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导法,在暗柳橙和猕猴桃上建立了以PMI安全标记基因为筛选基因的转化系统。主要结果如下:
(1)构建了两个以PMI基因为选择标记基因,分别由35SP和PSP驱动密码子优化抗菌肽D基因的植物表达载体:pHQ01(将35S启动子驱动的抗菌肽D基因构建到PMI基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301-PMI上)、pHQ02(将PSP启动子驱动的密码子优化抗菌肽D基因构建到PMI基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301-PMI上)。
(2)以暗柳橙实生黄化苗上胚轴和猕猴桃实生无菌苗叶片为外植体,研究了不同组合的甘露糖和蔗糖对暗柳橙上胚轴和猕猴桃叶片诱芽的影响,结果表明,在暗柳橙和猕猴桃转化实验中,以甘露糖为筛选剂时,甘露糖的筛选浓度以25 g/L为宜。
(3)新植物表达载体(pHQ02)转化暗柳橙上胚轴和猕猴桃无菌叶片,对获得的猕猴桃抗性植株进行CPR、PCR和RT-PCR检测,结果表明:对获得的暗柳橙抗性芽随机挑取进行CPR检测,显色结果表明PMI基因的表达率为15%,但PCR阳性率为0;PMI基因和抗菌肽D基因已经整合猕猴桃基因组中并得到表达,其转化率为5.2%。