近年来,随着人们生活方式和饮食结构的改变,加之日益严重的环境污染,恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的多发病、常见病。据WHO的统计数字显示,全球每年患恶性肿瘤的人数达1200万,到2020年全球肿瘤发病率将上升50%。在过去的半个世纪中,治疗恶性肿瘤的方法主要有外科手术、放射治疗及化学药物的治疗,但化学药物杀伤肿瘤细胞时往往累及正常细胞,尤其是造血组织和细胞,常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反应,同时还容易产生抗药、耐药性及不同程度的致突变遗传毒性。此外,尚有一部分癌肿对化疗无反应,导致治疗困难。因此,寻求疗效好且毒副作用低的治疗方法和药物成为临床治疗癌症的迫切需求。在经历了化学合成药物的多次药害之后,人们逐渐将目光转向了自然界,从中草药植物中寻找毒副作用小,疗效独特的抗癌及辅助药物成为治疗肿瘤的希望和新途径,并且是当今肿瘤研究的热点之一。中草药药源广泛、价格低廉、应用历史悠久,具有不良反应少、遗传毒性低等优点,可以在治疗癌症的同时对机体的功能从根本上进行恢复,增强病人免疫力,延长生存期,是当前防治肿瘤新药研发的热点。中草药次生代谢产物在化合物类型、结构上表现出多样性和复杂性,是一个天然形成的“组合化学样品库”,存在着广泛的生物活性物质。据统计,我国当前已对药用植物中28个科(属)的3000多种中草药进行了抗癌筛选,其中含有抗癌活性成分的中草药约有200种,然而苔藓植物因其个体微小不易识别,混杂丛生不易收集,缺乏直接的经济价值而淡出人们的视野。近年来,研究者从苔藓植物中分离获得了大量结构独特、生物活性显著的化合物,其中许多可作为新药研究的良好先导化合物,具有巨大的潜在应用价值。大金发薛(Polytrichum commueL.ex Hedw.)属于藓纲、金发藓目、金发藓科、金发藓属植物,又名独根草、土马鬃等,生于林下湿地,广泛分布于我国南北各地。其作为药用苔藓被收录在《本草纲目》及《中华本草》中,全草入药,味甘,性寒,主治阴虚骨蒸,潮热盗汗,肺痨咳嗽,血热吐血等症。早在1952年,Morris Belkin等研究发现,桧叶金发藓(Polytrichum junipurum Hedw.)的乙醇提取物和酸提取物能使小鼠sarcoma 37肉瘤坏死。在1977年《本草纲目》(校点本)中记载大金发藓对淋巴细胞白血病具有一定抑制作用。90年代初,Guo-qiang Zheng等学者从金发藓属的多形拟金发藓(PoPytrichum ohiionse Ren&Card)中分离出5种新结构骨架的苯并萘并呫吨酮类化合物(benzonaphthoxanthenones),从变形金发藓[Polytrichumpallidisetum(Funck)G.Sm.]中得到3种新型苯并萘并咕吨酮类化合物(benzonaphthoxanthenones)和2种新结构的联苄并苯乙烯醛基(cinnamoyl bibenzyls)化合物。这些化合物对9PS小鼠白血病细胞和多种人类肿瘤细胞(A-549肺癌、MCF-7乳腺癌、HT-29结肠癌、RPMI-7951黑色素瘤和U-251胶质瘤)表现出细胞毒性。傅芃等在2009年从大金发藓中新分离出3种化合物(S,Z)-5-苯乙烯基-7-羟基二氢黄酮(communinA),(S,E)-5-苯乙烯基-7-羟基二氢黄酮(communin B)和苯并萘并咕吨酮衍生物(ohioensinF)。其中,communinB和ohioensinF对A-549人肺癌肿瘤细胞株,LOVO人肠癌细胞株,MDA-MB-435人乳腺癌细胞株,HepG2人肝癌细胞株,6T-CEM人T细胞白血病细胞株,均显示一定的细胞毒活性,而6T-CEM人T细胞白血病细胞对药物处理最为敏感。以上研究结果提示,大金发藓在抗肿瘤特别是白血病治疗中具有潜在应用价值。本研究采用秦巴山区药用苔藓大金发藓为研究材料,首先通过试管法、纸色谱法、高效液相色谱仪,分析了大金发藓乙醇提取物及各极性成分组的化学成分;进而选择不同肿瘤细胞,利用MTT法对大金发藓抗癌活性成分进行筛选;然后采用流式细胞仪、荧光显微镜、扫描电子显微镜、激光共聚焦显微镜、免疫印迹、单细胞凝胶电泳等技术,研究了大金发藓乙醇提取物及其乙酸乙酯成分组对L1210细胞的杀伤作用及其分子机制。目前得到研究结果如下:1.大金发藓乙醇提取物(EPCLH)中含有生物碱、黄酮、皂苷、蒽醌、香豆素类化合物,氯仿成分组中主要富含生物碱类化合物,乙酸乙酯成分组中以黄酮类成分为主,正丁醇成分组则富集了大量皂苷类化合物;高效液相色谱图显示从EPCLH中共分离得到17个特征峰,比较大金发藓各极性成分组间所得峰谱,结果说明各成分组已实现完全分离且所含化学成分保持完整。2.EPCLH能显著抑制离体培养的L1210小鼠白血病细胞的增殖活性,但对MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌细胞的毒性作用稍弱,能够一定程度上影响人鼻咽癌Eca-109细胞和人结直肠癌SW-480细胞的生长,但对人结直肠癌SW-620细胞的增殖无明显抑制作用。相同条件下,EPCLH几乎不影响人肾胚上皮细胞HEK-293的生长。3.大金发藓乙酸乙酯成分组(EEF)对白血病细胞的杀伤能力最为突出,对L1210细胞、K562细胞及U937细胞的半数抑制浓度分别为34.56 μg/mL、44.40μg/mL和67.21 μg/mL。将EEF(15～55 μg/mL)作用于HEK-293人肾胚上皮细胞,其存活率均不低于90%。4.比较相同条件下采集的大金发藓孢子体和配子体乙醇提取物的细胞毒性,结果显示相同药物浓度下,大金发藓孢子体乙醇提取物对L1210细胞、K562细胞及U937细胞的增殖抑制能力明显优于其配子体。5.大金发藓乙醇提取物(EPCLH)作用于L1210细胞后,细胞核形态发生明显变化,流式细胞仪检测结果显示磷脂酰丝氨酸发生外翻的细胞百分比与药物剂量呈现正相关,同时细胞线粒体膜电位随药物剂量增大而显著下降。以上结果提示,EPCLH对L1210细胞的增殖抑制可能通过诱导其发生凋亡而实现,在此过程中线粒体结构与功能的损伤可能是诱因之一。6.大金发藓乙酸乙酯成分组(EEF)能够诱导L1210小鼠白血病细胞发生凋亡,且线粒体途径可能在凋亡发生中起关键作用;EEF可促使细胞内ROS含量显著上升,加入NAC可明显提升细胞存活率,并缓解由EEF导致的细胞线粒体损伤,还可在一定程度上降低药物造成的细胞DNA片段化比例,提示ROS在EEF诱导细胞凋亡过程中扮演重要角色;EEF还可将细胞周期进程阻滞在S期,并对细胞膜产生损伤,同时影响细胞内钙离子水平的变化。