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本研究旨在利用香蕉二级体细胞胚培养的方法获得再生植株,并克隆香蕉成熟相关基因类受体蛋白激酶基因,同时利用构建RNAi植物表达载体遗传转化香蕉胚性愈伤组织的方法,初步鉴定该基因的功能。 香蕉再生体系的优化。采取香蕉未成熟雄花,拨去多余的苞片后,切薄片,在适当的培养基上通过胚培养途径,即:未成熟雄花→胚性愈伤组织→胚性细胞→体细胞胚→胚的萌发→生根植株,共获得9株再生香蕉植株。通过该途径获得的新生的香蕉植株,为单细胞起源,克服了器官发生途径易产生嵌合体的情况,且培养周期仅6个月左右,大大缩短了香蕉转基因植株的再生的时间。建立了用二级体细胞胚培养的途径进行香蕉植株再生的方法。 香蕉类受体蛋白激酶的克隆。根据SSH和微列阵法获得的香蕉成熟相关类受体蛋白激酶基因片断,利用噬菌斑原位杂交和RACE相结合的方法,获得一个1689bp长的基因片断,用BLAST软件分析,该片断与已克隆的香蕉类受体蛋白激酶基因有40%的同源。RACE结果显示,5’端可获得1800bp的DNA片断,3’端可获得1000bp左右的片断。 RNAi植物表达载体的构建。本研究所构建的RNAi植物表达载体实际上是一个ihpRNA结构,该结构包括一条正义和一条反义的臂,两条臂中间有一段类似于内含子的结构,这种结构有助于提高其沉默的效率。S.Varsha Wesley(2001)利用hpRNA结构,对不同的植物,臂长在98~853bp,分别构建不同的表达载体,结果显示,可以使90~100%的转基因植物产生基因沉默现象,并且,这种方式比共抑制或反义RNA的方式产生基因沉默的效果更好,这种基因沉默表达系统可以应用于植物基因功能鉴定和发现新功能基因。