论文部分内容阅读
目的：Usp28（Ubiquitin-specific protease28，Usp28）是去泛素化水解酶家族中最新的抗肿瘤靶标分子，它通过控制癌蛋白MYC（Myelocytomatosis virusoncoprotein，MYC）和促癌蛋白LSD1（Lysine-specific demethylase1，LSD1）的细胞内稳定性而在癌症的发生和发展过程中发挥作用。而更为有趣的是，生物信息学分析表明Usp28的功能有极高概率受蛋白质翻译后修饰形式-SUMO化修饰与泛素化修饰的交叉调控。本论文基于核磁共振技术的相关研究工作，确定了这一交叉调控机制的存在，同时在分子水平阐明了其工作机制和结构基础，为癌症的靶向治疗奠定重要理论基础。方法：（1）使用Usp28(1-651)（含泛素/SUMO结合结构域UBA、UIM/SIM和催化结构域USP）和Usp28(121-651)（仅含催化结构域USP）蛋白质样品进行去泛素水解酶活性实验以确证泛素结合结构域对Usp28催化活性正常展示的必要性；（2）使用Ub-AMC荧光法检测SUMO1/SUMO2分子对Usp28(1-651)及其突变体水解底物（Ub-AMC）的能力，对所得的数据进行统计分析以明确SUMO1/SUMO2分子的非共价结合对Usp28酶活性的影响；（3）运用异核多维NMR技术测定Usp28(1-120)的溶液结构，并使用Usp28(1-120)、泛素、K48偶联的二泛素、SUMO1以及SUMO2进行[1H,15N] HSQC滴定实验以阐明Usp28底物识别和功能调控的分子机制；（4）以人基因组为模板，运用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增Usp28催化结构域片段，并进一步将PCR扩增产物克隆到pET-系列的表达载体中，构建Usp28催化结构域的重组表达质粒。结果：（1）N端泛素结合结构域的缺失会导致Usp28的去泛素水解活性明显降低；（2）SUMO1/SUMO2分子通过与Usp28N端UIM/SIM结构域发生非共价相互作用而抑制Usp28的去泛素水解功能；（3）Usp28(1-120)通过其UBA(ubiquitin-associated domain)结构域和UIM结构域(ubiquitin-interactingmotif)与泛素以及二泛素的β疏水界面发生相互作用；（4）Usp28(1-120)通过其SIM (SUMO interacting motif)结构域与类泛素蛋白SUMO1/SUMO2的疏水界面发生相互作用；（5）SUMO分子的非共价结合会屏蔽Usp28泛素结合结构域与泛素链之间的相互作用而使得Usp28的泛素链底物识别、结合能力受损；（6）基因测序和大肠杆菌表达结果证实：Usp28催化结构域的表达质粒已成功构建。结论：Usp28N端泛素结合结构域（UBDs，ubiquitin-binding domains）的泛素识别结合能力对Usp28的去泛素水解催化活性具有正调控作用。此外，Usp28的酶催化功能同时受到类泛素修饰分子SUMO和泛素分子的交叉调控。SUMO分子的非共价结合会屏蔽Usp28泛素结合结构域与泛素链之间的相互作用，从而使得Usp28的泛素链底物识别、结合能力受损，并进一步导致Usp28的酶活性降低。