【摘 要】
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酿酒酵母作为乙醇发酵工业中常用菌株,在发酵过程中常常会受到胁迫因子的影响,例如在实际生产中使用酵母发酵木质纤维素来生产乙醇时,木质纤维素水解液中的乙酸会影响其发酵性能。因此,本实验采用ARTP-UV复合诱变结合全基因组重排技术,使酿酒酵母诱变菌株与耐乙酸粟酒裂殖酵母的遗传物质重排重组得到融合菌株,从而选育耐乙酸的菌株,并检测其生长性能以及发酵性能。具体研究如下:（1）首先,通过ARTP诱变育种技术
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酿酒酵母作为乙醇发酵工业中常用菌株,在发酵过程中常常会受到胁迫因子的影响,例如在实际生产中使用酵母发酵木质纤维素来生产乙醇时,木质纤维素水解液中的乙酸会影响其发酵性能。因此,本实验采用ARTP-UV复合诱变结合全基因组重排技术,使酿酒酵母诱变菌株与耐乙酸粟酒裂殖酵母的遗传物质重排重组得到融合菌株,从而选育耐乙酸的菌株,并检测其生长性能以及发酵性能。具体研究如下:（1）首先,通过ARTP诱变育种技术对酿酒酵母AY12诱变27 s,将诱变菌株涂布至含乙酸胁迫的筛选培养基上,获得80株含有正向突变的菌株。将所得诱变菌株利用杜氏小管以及耐受性点板实验进行筛选后,获得5株耐乙酸性表现优异的菌株。通过玉米水解液发酵实验发现这5株菌株的乙酸耐受性能都得到提升,其在乙酸胁迫环境条件下乙醇产量有提升。（2）其次,采用紫外诱变育种技术对ARTP诱变菌株进行诱变40 s,并将复合诱变菌株涂布至乙酸胁迫筛选培养基上,获得260株复合诱变菌株,然后利用杜氏小管以及耐受性点板实验进行筛选,最终获得10株耐乙酸菌株。通过进行玉米水解液模拟发酵实验发现,复合诱变得到的10株菌株在乙酸胁迫环境下发酵产生的乙醇量都有所提升,其中U54、U78、U80菌株发酵结束后乙醇产量提升了9%、8%、10%。（3）最后本实验使用0.5%浓度的蜗牛酶,30℃,180 r/min处理40 min获取再生率高的诱变菌株的原生质体。使用2.5%以及0.5%的纤维素酶,30℃,180 r/min处理6 h 40 min制备粟酒裂殖酵母原生质体,并对其原生质体高温灭活。通过两轮原生质体融合使粟酒裂殖酵母与酿酒酵母发生遗传物质的重排与重组,获得融合菌株24株,然后利用耐受性点板实验筛选获得11株耐乙酸菌株。经发酵实验验证,11株菌株的耐乙酸性能都得到了提升。其中融合菌株RA18、RA24、RA26、RS3、RS23在乙酸胁迫环境下的模拟发酵实验乙醇产量比出发菌株AY12的乙醇产量分别增加了13%、17%、12%、14%、13%。本实验探索了多种诱变并结合细胞融合的全基因组重排技术的酵母突变育种策略,为工业菌株的选育提供了思路。
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